精子的细胞质膜是一种非常重要的细胞结构，它能够保护精子免受细胞外环境的刺激，膜上结合的酶及受体使细胞对外界刺激做出相应的生理反应，质膜还主宰着胞内外的物质运输。质膜在哺乳动物精子获能的过程中，精卵结合的受精作用过程中都是必不可少的结构。细胞膜结构如此重要，而占细胞膜表面积一半以上的脂筏结构则是细胞膜的核心结构，细胞膜对超低温冷冻时分敏感，说明此时质膜的损伤与脂筏结构改变可能有着密切的关系。脂筏是一种富含磷脂和胆固醇位于质膜外小页的动态微结构域，脂筏中含量很高的胆固醇在结构微域中起着粘着作用，如果胆固醇被剔除，脂筏中的抗去垢剂蛋白变的很容易提取，而脂筏的结构则被破坏变得松散，进而使质膜的许多功能受到破坏。质膜在生理功能上也起着非常重要的作用，能够保证物质的跨膜运输、信号与能量的传递以及化学反应的进行，最重要的是质膜为多种维持生命的化学反应提供了表面，有很多不同种类的酶定位在膜上，所以大部分生化反应在膜表面进行，这些生化反应是细胞供能的主要途径，也与精子的活力与受精能力密切相关。因此，冷冻对于质膜的损伤也涉及到对相关酶类蛋白的损伤，所以对于一些代谢相关酶类的检测也是非常重要的。　　本研究主要围绕脂筏相关蛋白的改变进行:(1)精子经过不同的超低温冷冻方式进行冷冻保存，解冻后检测鲜精和冻精中三种腊筏蛋白(Flotillin-1，Flotillin-2，Caveolin-1)，八种代谢相关蛋白（AKT1，Sodium potassium ATPase，PARP，ATP citrate lyase, ACADM，GAPDH，Hexokinase, GLUT1）及两种热应激蛋白(HSP90，HSP70)的表达量的变化情况;(2)精子在冷冻前通过胆固醇搭载环糊精药品（Cholesterol-loaded Cyclodextri，CLC）孵育处理将胆固醇转入精子细胞中，用甲基-β-环糊精（Methyl-beta-cyclodextrin, MβCD）剔除精子细胞中的胆固醇，检测这两种情况及对照组中以上几种蛋白的表达情况，以及检测各个实验组中ATP，MDA等常规实验指标。(3)精子解冻后检测其表观形态及超微结构的改变。具体实验过程中以黄颡鱼为实验对象，所涉及的实验方法包括:精子的超低温冷冻分别采用泡沫船和程序冷冻仪来完成;提取蛋白采用蛋白质免疫印迹(Western blot)方法检测几种蛋白在鲜精和冻精以及胆固醇导入和剔除时的表达情况;通过利用碧云天生物技术公司的ATP检测试剂盒(ATP Assay Kit)检测胆固醇转入和剔除后样本中ATP的改变情况;通过利用碧云天生物技术公司的脂质氧化(MDA)检测试剂盒（Lipid Peroxidation MDA Assay Kit）检测胆固醇转入和剔除后样本中丙二醛(MDA)这种过氧化指标的改变;利用苏木精伊红染色法检测各组精子样本表观形态的改变，通过透射电镜技术对样本进行包埋，获得半薄及超薄切片，观察各组样本超显微结构的改变。　　本研究以实验室建立并优化的黄颡鱼精子冷冻方案为基础，根据脂筏蛋白在精子质膜中的重要作用，探索黄颡鱼精子在经过冷冻保存之后脂筏蛋白、代谢相关蛋白及热应激蛋白的改变情况。首先研究超低温冷冻对脂筏蛋白、代谢相关蛋白及热应激蛋白的影响，实验分为鲜精组，好方案冻精组(9cm)及差方案冻精组(17cm)三组。实验结果表明:黄颡鱼精子在冷冻过后活力显著下降，并且好的冷冻方案(9cm)与差的冷冻方案(17cm)相比具有显著性的优势(P＜0.05)。　　三种脂筏蛋白（Flotillin-1，Flotillin-2及Caveolin-1）的表达水平在冻精中的表达量与鲜精中相比明显下降(P＜0.05)，两组冻精之间的脂筏蛋白表达量没有显著性差异（P≧0.05），较差冷冻方案冻精中的表达量最低。在代谢相关蛋白中，ATPase蛋白在精子冷冻之后表达量显著下降(P＜0.05)，但两组冻精之间的表达量没有显著性差异（P≧0.05）;ATP citrate lyase蛋白的表达量在鲜精组与好冷冻方案组间没有显著性差异(P≧0.05)，与较差冷冻方案的表达量相比有显著差异(P＜0.05);Hexokinase蛋白在鲜精中的表达量最高，两组冻精处理组之间没有显著性差异（P≧0.05）;GAPDH蛋白在经过冷冻后表达量有显著下降(P＜0.05)，在两组冻精之间没有显著性差异（P≧0.05）;GLUT1蛋白在经过冷冻后表达量有显著下降(P＜0.05)，在两组冻精之间没有显著性差异(P≧0.05)，较差冷冻方案中的表达量最低;ACADs蛋白的表达量在鲜精组与好冷冻方案组间没有显著性差异（P≧0.05），与较差冷冻方案的表达量相比有显著差异(P＜0.05);AKT1蛋白经过冷冻之后表达量也有显著下降(P＜0.05);PARP蛋白在经过冷冻后表达量有显著下降(P＜0.05)，且鲜精与两组冻精之间的表达量都有显著性差异（P＜0.05）;HSP90蛋白的表达量在鲜精与冻精之间有显著性差异(P＜0.05)，且两组冻精之间的表达量也有显著性差异(P＜0.05);HSP70蛋白的表达量在鲜精与冻精之间有显著性差异(P＜0.05)，在两组冻精之间没有显著性差异（P≧0.05）。　　胆固醇的导入与剔除对精子的影响。首先，胆固醇导入组的活力明显高于其它两组（P＜0.05），胆固醇剔除组的活力明显降低（P＜0.05）。胆固醇导入组的ATP含量最低，胆固醇剔除组的ATP含量最高，而对照组的ATP含量介于两者之间，但是各个处理组之间没有显著性差异（P≥0.05）;胆固醇导入后MDA的含量明显降低（P＜0.05），胆固醇导入后冻精中ROS的含量也明显降低(P＜0.05)。胆固醇加入组中三种脂筏蛋白（Flotillin-1，Flotillin-2及Caveolin-1）的表达量明显高于对照及胆固出剔除的两组冻精(P＜0.05)。胆固醇的导入与剔除对代谢相关蛋白都没有明显的保护作用，其中Sodium potassium ATPase蛋白，ATP citratelyase蛋白及PARP蛋白的表达量在几组冻精中没有明显的差异（P≥0.05），GAPDH蛋白在胆固醇导入组表达量在冻精中最高，但是各个处理组间没有显著性差异（P≥0.05），胆固醇导入组比其它两组冻精的表达量稍高，其它几种代谢相关蛋白在加入胆固醇后没有可重复的结果。　　精子经过冷冻之后，从宏观结构上看精子尾部受到非常严重的损伤出现卷曲、中断及丢失现象，从超显微结构上看不仅是精子尾部有损伤，精子质膜及线粒体的损伤也很严重，出现质膜丢失、破裂及线粒体丢失等现象。