1,3-甘油二酯（1,3-DAG）是一种健康的油脂，它能在体内以能量的形式释放而不会在体内积累，从而可以减少肥胖发生的机率。酶法制备1,3-甘油二酯是最为有效的方法，而脂肪酶是该法常用的一种酶。1,3-甘油二酯的脂肪酶法制备包括酯合成、甘油解、转酯化法、甘油三酯水解四种，其中最为简便的应为甘油三酯直接水解法，但这需要能专一性水解 Sn-2位酯键的脂肪酶参与，而该类型的脂肪酶在国内外报道极少。本课题组在富含油脂的土壤中筛选得到一株产高Sn-2位选择性且酶活较高的胞外脂肪酶菌株黑曲霉GZUF36。然而，该菌株产胞外 Sn-2脂肪酶性状出现了衰退。因此，本文从该菌株出发，对黑曲霉 GZUF36产胞外Sn-2脂肪酶性能的复壮、胞外Sn-2脂肪酶分离纯化、酶学性质、酶固定化进行研究，从而为进一步研究该酶酯键选择性机理做铺垫。　　首先对黑曲霉GZUF36稳定生产胞外Sn-2脂肪酶培养基的探索，发现培养基配方（牛肉膏0.5%，蛋白胨0.5%，橄榄油1.0%，硫酸铵0.2%，磷酸氢二钾0.5%，硫酸镁0.02%，氯化钙0.01%，氯化钠0.5%）能恢复其产酶性能。对该菌株产的胞外 Sn-2脂肪酶进行水解酶活力和油酸甘油三酯水解反应产物进行测定，发现水解酶活力为7.92±2.23 U/mL，1,3-DAG得率为16.34±1.27%，1,3-DAG选择性为82.67±3.01%。相较于衰退前的胞外Sn-2脂肪酶催化性能，该培养基下产的胞外Sn-2脂肪酶的水解酶活力和1,3-DAG得率偏低，但选择性已经恢复到先前水平，说明衰退的黑曲霉GZUF36重新复壮后仍能生产高Sn-2选择性的脂肪酶。而水解酶活力和1,3-DAG得率偏低可以通过培养基和培养条件优化来改善。　　其次对发酵液中胞外 Sn-2脂肪酶进行分离纯化，采用丙酮沉淀和反胶束萃取法相结合来实现。研究发现丙酮沉淀的最佳条件为：发酵液和丙酮的体积比为1:2.5，混合物在-18℃下沉淀1 h，在该条件下脂肪酶酶活力回收率为73.2±1.36%，纯化倍数为2.13±0.072。反胶束前萃取的最佳条件为：CTAB浓度为125 mM，有机溶剂体系75%异辛烷/15%正丁醇/10%正己醇（体积比）；水相 NaCl的浓度为0.075 M，pH为9.0；有机相和水相以体积比1:1混合，在30℃条件下萃取30 min，在该条件下前萃取效率达到了90.3±3.2%。反萃取的最佳条件：水相KCl的浓度为1.5 M，添加10%无水乙醇，pH为6.5；前萃取中含脂肪酶的有机相和上述水相以体积比1:1混合，在30℃条件下萃取1.5 h，该条件下反萃取效率为85.05±2.9%，纯化倍数为4.76±0.092。整个反胶束萃取过程的萃取效率（脂肪酶酶活力回收率）为76.8%，纯化倍数为4.76±0.092。经过丙酮沉淀和反胶束萃取两步提纯，整个过程的纯化倍数达到10.14。该纯化后的酶经过SDS-PAGE表征发现可以提纯至电泳纯，用 LC-MS/MS分析测定了该酶的氨基酸序列，在NCBI检索得出该酶属于脂肪酶家族。　　接着对纯化后的胞外Sn-2脂肪酶进行酶学性质研究。研究发现胞外Sn-2脂肪酶的最适温度为35℃，在低于25℃以下具有较好的稳定性，但对高温敏感；最适pH为6.5，在pH6.5-7的条件下该脂肪酶具有极强的稳定性，处理12小时后酶活力损失率仅为13.1%和14.7%，但在pH＜5或pH＞8的条件下保存12小时，酶活力损失率极高。Mg2+、Ca2+对脂肪酶活性具有较强的促进作用，而Zn2+、Mn2+、Al3+具有一定的抑制作用，Fe2+、Cu2+、Ni2+有极强的抑制作用。底物特异性研究发现：玉米油、芝麻油、大豆油对脂肪酶酶活力具有极大的促进作用，菜籽油和橄榄油效果相差不大，花生油略好于橄榄油，这可能是因为玉米油、芝麻油、大豆油含有的亚油酸量较多。酶动力学研究发现：该脂肪酶的Vmax和Km，分别为37.17 mM/min和9.28 mM。　　最后对海藻酸钠固定胞外 Sn-2脂肪酶的最佳条件进行研究。通过单因素分析及正交试验设计，固定化的最佳条件为：海藻酸钠浓度为3%、海藻酸钠与酶液的体积比为2:1、固定化时间为60 min，该条件下固定化效率为63.67±1.71%。对固定化酶进行重复6次橄榄油水解反应，发现固定化脂肪酶重复4次稳定性较好，仍能保持89.17±0.61%的酶活性，但是重复6次仅能保留73.91±1.58%的酶活性，这可能是由于固定化材料不太适合以及重复实验操作导致的酶损失等原因造成的。