蛇毒中含有丰富的蛋白酶类,如蛇毒类凝血酶和蛇毒磷脂酶A2(PLA2)等。这些蛇毒蛋白酶类不仅有相应底物的酶催化水解活性,还具有广泛的生物学功能。蛇毒类凝血酶都是通过第195位的丝氨酸攻击并切断纤维蛋白原分子的Arg-Gly肽键,以此产生水解作用。蛇毒PLA2则能够催化磷酸甘油三酯的sn-2位酯键的水解,生成脂肪酸和溶血磷脂。蛇毒类凝血酶和蛇毒PLA2都具有诸如溶血、凝血、抗菌、细胞毒性和神经毒性等功能,除此之外,蛇毒蛋白还能够结合到特定细胞受体上,影响细胞的功能调控。细胞内Ca2+浓度的调节对于维持细胞静息态下胞内低Ca2+浓度、调节细胞兴奋性、参与质膜上的Na+/Ca2+交换以及细胞的发育、老化和健康都非常重要。肌浆网钙库是平滑肌细胞内的主要Ca2+存贮库,钙库Ca2+释放对肌细胞兴奋-收缩耦联的触发起决定作用。在平滑肌细胞的肌浆网膜上,存在两类Ca2+释放通道：Ryanodine受体(RyRs)和IP3受体(IP3Rs)。两类通道协同调节肌浆网钙库Ca2+释放,引发平滑肌细胞兴奋并收缩。江浙蝮蛇粗毒在经过两步层析纯化并经过精氨酸酯酶活性的测定,得到蛇毒类凝血酶AhV_TL-I。利用N端测序及3’-RACE RT-PCR得到了该蛋白的氨基酸序列。AhV_TL-I包含239个氨基酸,与多数蛇毒类凝血酶具有较高同源性。序列分析表明AhV TL-I为糖蛋白,其糖含量约11%。它具有精氨酸酯酶活性和纤维蛋白原水解活性,并可被PMSF和Cysteine完全抑制,但一些天然的丝氨酸蛋白酶抑制剂(如SBTI、Leupeptin和Heparin)对其酶活只具有部分抑制效应。纳摩尔级浓度的AhV_TL-I即能够引起分离的小鼠胸主动脉环产生收缩效应,并且这种活性与其酶活性无关。研究发现,AhV_TL-I并不激活平滑肌细胞膜上的K+通道和Ca2+通道,却能够通过间接的调控激活细胞内肌浆网膜上的RyRs的开放。在AhV_TL-I的晶体结构模型中,能观察到Asn95A上糖基化修饰的存在。对其结构进行分析发现,Asn95-寡糖对99-loop的构象产生了非常大的影响。糖基化的修饰使得99-loop被“压扁”,从而向两侧伸展。伸展的结果导致99-loop远离类凝血酶的底物结合位点S2并占据结合位点S3/S4。99-loop的挤压同样使得174-loop更凸向蛋白表面,两者之间形成的底物结合裂缝消失。这从底物的亲和性方面解释了AhV_TL-I只具有较低酶催化活性的原因。另一方面,Asn95A-寡糖位于底物结合口袋上方,形成一种“糖介导的空间障碍”,同样降低了酶对底物的水解活性。去糖实验表明Asn95A-寡糖链的切除能够部分提高AhV_TL-I的酶催化活性,验证了我们对其结构分析上的猜测。37-loop上氨基酸的突变使得其天然大分子抑制剂结合位点的电性发生巨大改变,大量正电荷氨基酸的聚集改变了AhV_TL-I对抑制剂的选择性。对糖切除的AhV TL-I的功能分析表明,糖基化对于AhV_TL-I发挥血管收缩活性是必须的。这为蛇毒糖蛋白的研究提供了全新的视角。江浙蝮蛇粗毒和竹叶青粗毒经过多步层析法能够分别得到AhVbPA、 AhV_aPA和PA2-Vb、CTs-R6四个蛋白,它们皆属于蛇毒PLA2家族。序列分析表明,AhV_bPA和CTs-R6属于碱性PLA2,AhV_aPA和PA2-Vb为酸性PLA2。49位残基的不同可将这四种蛇毒PLA2分为两类：CTs-R6属于Asn49-PLA2,其余三者属于Asp49-PLA2。因此CTs-R6不具有磷脂水解活性,而AhV_bPA具有中等酶活性,AhV_aPA和PA2-Vb具有较高酶活性。对四者的结构分析表明,CTs-R6中Ca2+结合位点的变化使得其无法结合Ca2+离子,从而丧失酶催化活性。而酸性PLA2和碱性PLA2中i-face上的氨基酸变化使得两者的酶活性产生了较大的差异。AhV_TL-I在溶液中主要以二聚体形式存在,二聚体界面由C-loop和Ca2+-loop组成。PA2-Vb也具有二聚化的倾向,其在晶体中的二聚化作用界而主要由疏水的i-face构成。在AhV_bPA结构中有天然甘油磷脂的存在,它在AhV_bPA中的定位对于研究PLA2结合底物的方式提供了很好的帮助。除CTs-R6外,其余三种蛇毒PLA2都具有收缩小鼠胸动脉环的能力,并且与它们的酶活性无关。三种蛇毒PLA2分子同样不激活质膜上的离子通道的开放,而是通过间接的方式激活细胞内肌浆网上的IP3Rs来产生钙库Ca2+释放,从而引发平滑肌细胞的兴奋-收缩耦联。通过在组织和细胞层面对蛇毒蛋白激活Ca2+释放的实验进行分析,我们提出了AhV_TL-I和AhV_bPA、AhV_aPA、PA2-Vb调节钙库Ca2+释放的机制：蛇毒蛋白一方面可能通过结合到质膜上的特定受体上,引起受体构象变化,释放信使分子,信使分子通过胞内传递途径激活肌浆网的RyRs或IP3Rs;另一方面,蛇毒蛋白可能结合到质膜上的DHPR通道(或BKca、TRPC通道),通过通道与RyRs(或IP3Rs)的物理联系调控RyRs(或IP3Rs)的激活。RyRs或IP3Rs释放的钙库Ca2+进一步正反馈激活各种离子通道,诱发胞外Ca2+内流,刺激细胞收缩机器,产生收缩效应。这些研究结果为蛇毒类凝血酶和蛇毒PLA2的功能研究提供了新的方向。