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目的:骨折是常见的创伤性疾病,并且随着老龄化程度的加深,骨折的患病率逐渐上升,大约10%的骨折病例中会出现骨延迟愈合甚至骨不连等并发症。临床上对于此类并发症早有治疗手段,但是并没有统一的标准并且治疗效果个体差异很大。自体和血管化骨移植已被用于治疗骨折延迟愈合以及骨不连,但是治疗成本高在很大程度上限制了其应用,并且治疗效果因人而异。同时这类治疗方式恢复时间长、治疗成本高也是其临床广泛应用受限的因素。目前,骨组织修复及自愈的机制尚未得到完全的揭示,越来越多的研究重点转向有促进组织修复及再生能力的干细胞来源的囊泡上,囊泡是细胞内储存、运输以及消化产物及代谢废物的中间体,其中的miRNA作为一种良好的生物标志物在疾病进展及疾病治疗中发挥了巨大的作用,引起了极大的关注,本研究的目的首先培养骨髓间充质干细胞、分离鉴定其胞外囊泡（extracellular vesicles,EVs）、采用小鼠作为研究动物构建骨折模型用于后续研究,然后探讨骨折动物模型在来源于骨髓间充质干细胞分泌的囊泡（bone extracellular vesicles,B-EVs）刺激下差异表达的miRNA,并对其在骨折中的作用机制展开研究,以期为骨折的愈合及治疗提供更多帮助。方法:一、胞外囊泡（extracellular vesicles,EVs）的分离鉴定及骨折小鼠模型的构建:1.研究使用C57BL/6小鼠以及实验室改造完成并正常繁育饲养的C57BL/6 CD9-/-遗传型小鼠进行构建骨折模型;所用细胞为小鼠骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）。2.从培养4-6代的BMSCs中提取B-EVs,通过透射电镜、Western Blot以及纳米粒径分析仪鉴定E-BVs的形态、特异性蛋白（CD11b、CD 45、CD29以及CD90）的表达情况以及粒径大小;3.野生型（wild type,WT）和CD9-/-C57BL/6小鼠中使用C形工具施加三点弯曲产生横向股骨干骨折,在建模结束后的0、1、2、3、4周,对小鼠骨折模型骨愈合情况进行分析,通过高分辨SKYSCAN进行活体显微影像学分析、计算机断层扫描骨密度等进行分析,验证小鼠骨折模型。二、EVs干预下骨折小鼠模型中差异miRNA的鉴定:1.分组:使用第一章构建的小鼠模型进行研究,对小鼠进行进一步的分组,分别为WT+NC组（GW4869干预后,EV-NC注射的WT小鼠）、WT+EVs组（注射B-EVs的WT小鼠）、WT+EVs-Mock组（注射B-EVs的WT小鼠预先转染miR-335抑制剂NC）、WT+EVs-Inhibitor组（WT小鼠注射B-EVs预先转染miR-335 Inhibitor）;CD9-/-小鼠分别分为:CD9-/-+NC组（CD9-/-小鼠注射GW4869干预后的EV-NC）、CD9-/-+B-EVs组（CD9-/-小鼠注射B-EVs）、CD9-/-+EVs-Mock组（CD9-/-小鼠注射B-EVs预先转染miR-335 Inhibitor NC）、CD9-/-+EVs-Inhibitor组（CD9-/-小鼠注射B-EVs前转染miR-335抑制剂）。2.EVs的注射时间及剂量:各组小鼠均于骨折后第1天和第8天在骨折部位注射EVs 100μL或外泌体抑制剂GW4869作用下的EV-NC 100μL;3.使用p CDH质粒通过慢病毒转染建立过表达miR-335-inhibtor和EVs-Inhibitor的稳定骨细胞系;4.骨折建模后2周切取WT小鼠和CD9-/-小鼠股骨,将组织在4%缓冲多聚甲醛中固定48 h,随后用缓冲EDTA进行脱钙处理。5.免疫组织化学（immunohistochemistry,IHC）检测骨形态发生蛋白2（Bone morphogenetic protein 2,BMP2）;6.RT-q PCR检测差异表达miRNA的表达水平;7.放射免疫沉淀试验分析提取总蛋白;8.微阵列检测差异表达3只WT+PBS治疗的小鼠和3只WT+B-EV治疗的小鼠miRNA;9.通过SPSS21.0进行统计分析。Kolmogorov—Smirnov检验数据是否呈正态分布。测量数据以平均值±标准差表示。两组间比较应用t检验,多组采用单因素或双因素方差分析（ANOVA）,ANOVA分析后成对比较采用Tukey多重比较检验。三、microRNA-335通过囊泡相关膜蛋白（Vesicle associated membrane protein,Vapb）和典型Wnt/β-catenin通路（Canonical Wnt/β-catenin pathway,Wnt/β-catenin）促进骨折恢复:1.MTT检测成骨细胞样细胞MC3T3和MG63的活力;2.Tunel及Alizarin red检测成骨细胞样细胞MC3T3和MG63细胞凋亡,未分化的ADSCs（无细胞外钙沉积）呈微红色,而ADSC来源的成骨细胞（有细胞外沉积）呈亮橙红色;3.碱性磷酸酶染色检测培养小鼠骨细胞,使用AP染色液进行染色,使用光学显微镜对红染细胞集落与无色集落进行计数,荧光显微镜下观察细胞;4.依据Lipofectamine 2000的说明书,将质粒分别与mimic NC或mimic miR-335共转染HEK293T细胞。使用Dual-Glo?双荧光素酶报告基因检测系统验证miR-335和Vapb之间的结合关系;5.RNA pull down检测蛋白作用关系,使用识别RBP的一抗来检测目标RBP与适当的第二抗体一起孵育以识别第一抗体,并使用增强型化学发光检测信号;结果:一、EV的分离鉴定及骨折小鼠模型的构建:1.首先我们对购买的鼠BMSCs细胞进行鉴定,荧光显微镜分析成骨细胞标志酶及流式细胞分析特异性抗体均证实了细胞的正确性;2.BM-MSCs细胞中提取EVs,通过纳米粒径分析、透射电镜分析及Western Blot分析结果证明分离得到的B-EVs的正确性,可以用于本研究;3.两组小鼠在建模前即可检测时,野生型小鼠的体重和骨密度无显著差异,CD9-/-小鼠胫骨生长板的宽度显著减少,野生型小鼠在骨折后2周通过骨痂形成表现出软骨内骨化,3周时骨愈合明显,与野生型小鼠相比,CD9-/-小鼠表现出骨折愈合的显著延迟。骨折后3周CD9-/-小鼠骨愈合率为25%,明显低于野生型小鼠,表明与野生型小鼠相比,CD9-/-小鼠的愈合能力下降;二、EVs干预下骨折小鼠模型中差异miRNA的鉴定:1.HE染色显示B-EV处理促进了骨组织的形成,甲苯胺蓝染色显示B-EV处理增加了软骨组织,BMP2免疫组化显示B-EV处理促进了成骨细胞的分化和骨折的恢复;EVs对CD9-/-小鼠的治疗作用明显低于WT小鼠;2.与WT小鼠相比,EV处理后的CD9-/-小鼠软骨组织中73个miRNA下调,104个miRNA上调,挑选差异表达最显著的miR-335、miR-136、miR-125a、miR-217、miR-487a、miR-339、miR-298和miR-133a进行后续实验;3.EvimiRNA在线预测网站上分析miR-335的分布,结果发现,miR-335在骨髓间充质干细胞中含量丰富,我们推测miR-335可能在骨折的修复中发挥作用。4.外泌体抑制剂GW4869对B-EVs的分泌无明显影响;5.HE染色、甲苯胺蓝染色及BMP2免疫组化结果显示B-EV中miR-335对小鼠骨折恢复具有促进作用;三、microRNA-335通过Vapb和Wnt/β-catenin通路促进骨折恢复:1.MTT方法检测了成骨细胞MC3T3和MG63细胞的增殖率,结果发现EVs的处理促进了细胞增殖。TUNEL染色结果显示,EV处理可抑制细胞凋亡;2.F-actin的免疫荧光染色观察了MC3T3和MG63细胞的细胞粘附,发现B-EV处理对细胞粘附无明显影响;3.人I型胶原蛋白（Human type I collagen,ColⅠ）的免疫荧光染色证明B-EVs促进ColⅠ表达,与茜素红染色结果一致。RT-q PCR和western blot分析验证B-EV处理可增加α-SMA、OCN、GDF-10和FGF-2的水平;4.RT-q PCR显示EVs-Inhibitor处理后miR-335表达明显下降,并伴有细胞增殖率的下降和细胞凋亡的增加。而且,ALP、茜素红和ColⅠ免疫荧光染色发现,B-EVs携带的miR-335的干预部分抵消了B-EVs对MC3T3和MG63细胞成骨细胞分化的促进作用;5.囊泡相关膜蛋白（Vesicle associated membrane protein,Vapb）能促进破骨细胞的生长,因此我们重点研究了Vapb,HEK293T细胞中的双荧光素酶报告基因检测显示miR-335可以靶向Vapb;6.RT-q PCR和western blot分析检测小鼠和细胞中Vapb水平。结果显示,EV处理抑制了Vapb水平,而miR-335抑制可以缓解Vapb的抑制;7.miRwalk、Target Scan、EvimcrRNA和Starbase的网站上预测并筛选了miR-335的7个靶基因（SMARCA2、Vapb、NAA25、KLHL28、NUCKS1、RCC2和RBFOX2）,通过文献调研,我们发现囊泡相关膜蛋白（Vesicle associated membrane protein,Vapb）能促进破骨细胞的生长。使用RT-PCR和western blot鉴定过表达Vapb细胞的构建情况,RT-q PCR显示,转染后细胞中Vapb mRNA的表达明显增加,使用western blot在蛋白中观测到了相似结果;MTT检测细胞活力及TUNEL染色检测细胞凋亡的结果表明,过表达Vapb细胞的细胞伴有细胞增殖率的下降和细胞凋亡的增加,表明Vapb过表达诱导细胞凋亡;Vapb过表达部分抵消了B-EVs对MC3T3和MG63细胞成骨细胞分化的促进作用。8.过表达Vapb可逆转EVs对Wnt和β-catenin蛋白表达的促进。提示EVs中靶向Vapb的miR-335可能与Wnt和β-catenin通路有关。结论:1.本研究成功的构建野生型小鼠及CD-9-小鼠骨折模型并从骨髓间充质干细胞中成功分离得到囊泡,其有助于小鼠骨折的愈合。2.骨髓间充质干细胞来源囊泡中miR-335促进成骨细胞分化及骨组织生成。3.miR-335靶向Vapb,囊泡干预组的细胞中过表达Vapb抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,减弱了囊泡促进成骨细胞分化作用。4.髓间充质干细胞来源囊泡中的miR-335通过Vapb和Wnt/β-catenin通路促进骨折愈合。本研究可能为骨折治疗提供见解。