背景：胰岛细胞移植不仅可以改善1型糖尿病患者的血糖控制，避免强化胰岛素治疗导致的低血糖昏迷，而且能阻止甚至逆转糖尿病并发症。临床上胰岛移植90%经门静脉移植到肝脏，但是移植过程中细胞丢失严重，胰岛在肝脏不能长期存活以及移植后容易发生立即经血液介导的炎症反应，所以研究者希望能找到更合适胰岛移植的部位。天然移植部位包括肺、肝、脾脏的血管内，胰腺、皮下、肌肉、骨、肾包膜、网膜囊等组织和器官内，免疫豁免区如大脑、胸腺、睾丸等已被探索是否可以作为胰岛移植部位。但是这些天然的移植部位若应用于临床时均存在很多不足，相比之下，利用人工装置构建胰岛移植部位显现出良好的临床应用前景。我们实验室在前期的研究中构建了一种在体硅胶室。这种由硅胶材料制作、中空、表面带孔的室性装置植入皮下后，组织液可通过室表面的孔聚集在室内。对室内组织液的成分进行分析后发现其中含有多种生长因子，并且这些组织液能够在体外支持多种细胞的存活及分裂增殖。此外将软骨细胞/支架材料复合物放入在体硅胶室后，能构建出组织工程软骨。这些研究结果表明，这样一种室性装置不仅能在体构建出一定的物理空间供细胞移植，而且室内聚集的组织液能够维持细胞存活。因此我们认为这种在体室性装置有望作为内分泌细胞的移植部位，尤其是对于主要受局部微环境中葡萄糖调控的胰岛细胞。目标：⑴建立分离和纯化小鼠胰岛的标准化方法；⑵探讨组织液体外培养胰岛细胞时是否可以维持其活力及功能；⑶探索在体硅胶室作为胰岛移植部位的可行性；⑷观察在体硅胶室内移植胰岛对糖尿病小鼠血糖的调控。方法：⑴胰岛获取：采用在体胆总管灌注胶原酶P（1.3U/ml）方法，分离C57BL/6J小鼠胰岛，Histopaque1077密度梯度离心及手检胰岛两步法纯化胰岛。①采用DTZ染色法鉴定胰岛，计算每只胰腺的产出。②葡萄糖刺激胰岛素分泌实验，计算葡萄糖刺激指数，评估胰岛的内分泌功能。⑵体外实验：①将硅胶室植入小鼠背部，定期收集室内组织液备用。②小鼠胰岛细胞培养：分别用含5.5mM和11mM葡萄糖浓度的组织液与RPMI1640培养液（10%胎牛血清）体外培养胰岛细胞2周，AO-PI染色鉴定胰岛细胞活性，葡萄糖刺激胰岛素分泌实验评估胰岛细胞功能。⑶可行性研究：①硅胶室内组织液糖与血糖关系的研究：腹腔注射葡萄糖，分别在0、15、30、60、90、120min检测血糖及室内组织液中葡萄糖水平并做分析。②室内胰岛素调控血糖的研究：研究不同给药途径（硅胶室内、皮下、腹腔内）下血糖的变化。⑷体内研究：①采用链脲佐菌素按200g/kg体重单次腹腔注射诱导1型糖尿病小鼠模型。②胰岛细胞移植2周前于小鼠背部植入硅胶室。③实验分组：正常对照组（正常小鼠植入或不植入硅胶室），糖尿病对照组（糖尿病小鼠植入或不植入硅胶室），硅胶室内胰岛移植组及及肾包膜下胰岛移植组。④移植后前4周测随机血糖，移植第5周行腹腔葡萄糖耐量试验，之后取材做HE染色及免疫组化染色。⑸统计方法：用统计软件Prism5.0进行统计分析，计算各组的均数和标准误，完全随机设计的实验采用One-wayANOVA与Tukey’s检验进行多组间的相互比较，随机区组设计的实验采用随机区组设计资料的方差分析，曲线下面积由统计软件按梯形规则计算得到。认为P<0.05有统计学差异。结果：⑴成功分离纯化胰岛细胞：①经密度梯度离心及手检胰岛两步法纯化得到的胰岛细胞纯度较高。②每只胰腺平均产出胰岛细胞约145±27.5个。③分离的胰岛细胞葡萄糖刺激指数SI为4.04±0.9。⑵组织液能在体外维持胰岛细胞的存活及功能：①小鼠在体硅胶室内组织液色淡黄、呈清亮状，组织液中葡萄糖浓度为5.5mM。②胰岛细胞体外培养2周时，组织液培养组中胰岛细胞外缘细胞突起较少，而RPMI1640培养组中细胞向外伸展形成较大的触角。③组织液组（5.5mM）、组织液组(11mM)、RPMI1640培养组(11Mm)、RPMI1640培养组（5.5mM）活细胞率分别为91%、84%、76%和63%。④各组的葡萄糖刺激指数（SI）分别为3.81±0.72，2.72±0.63，2.63±0.81，1.33±0.79。组织液体外培养胰岛细胞时，细胞的形态、活力及功能均好于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液；而且含5.5mM葡萄糖的组织液优于含11mM葡萄糖的组织液，但是含11mM葡萄糖的RPMI1640培养液优于含5.5mM葡萄糖的RPMI1640培养液。⑶在体硅胶室内组织液中葡萄糖的变化能反应血糖的变化，只是血糖在短时间内剧烈升高时，组织液中葡萄糖升高时间上相对滞后于血糖；室内胰岛素可以调控全身血糖。①STZ诱导糖尿病小鼠造模成功率为81%。②糖负荷前，血糖与硅胶室中组织液中葡萄糖浓度分别为3.9±1.3mmol/L和3.0±1.1mmol/L，两者无统计学差异（P>0.05）。糖负荷15min时，血糖在这一时间内快速上升至17.2±2.3mmol/L，而硅胶室内组织液中葡萄糖浓度为7.8±1.9mmol/L，两者有统计学差异（P<0.05），糖负荷30min时，两者均达到峰值。之后，血糖与室内组织液中葡萄糖浓度缓慢下降，在各时间点均无统计学差异（P>0.05）。③在体硅胶室内胰岛素在降血糖的时间和效应方面，与皮下注射、腹腔注射没有统计学差异（P>0.05）。⑷在体硅胶室内移植胰岛后可逆转糖尿病小鼠高血糖：①胰岛素、胰高血糖素免疫组化染色证实硅胶室内及肾包膜下移植胰岛细胞形态及功能维持良好。②随机血糖检测结果显示胰岛细胞移植到在体硅胶内可逆转糖尿病小鼠高血糖。③IPGTT中，硅胶室内胰岛移植组血糖变化趋势与肾包膜下胰岛移植组及正常对照组基本一致。④糖负荷0-15min，硅胶室内胰岛移植组血浆中胰岛素总量低于肾包膜下胰岛移植组及植入硅胶室的正常对照组，有统计学差异（P<0.05）。硅胶室胰岛移植组胰岛素AUC0-15和AUC15-30分别低于肾包膜下胰岛移植组38%和15%，但两组胰岛素AUC30-60和AUC0-120没有统计学差异（P>0.05）。⑤糖负荷15min时，血中葡萄糖浓度高于硅胶室内组织液中的葡萄糖浓度，有统计学差异（P<0.05）。之后各时间点，组织液中葡萄糖浓度与血糖浓度无统计学差异(P>0.05)；糖负荷30min时，胰岛移植组室内组织液中葡萄糖浓度达峰值，胰岛素浓度也达峰值。此时，胰岛移植组室内组织液中葡萄糖浓度与植入硅胶室的糖尿病对照组相比，无统计学差异(P>0.05)，而胰岛素远远高于对照组，有统计学差异（P<0.05）。结论：⑴小鼠胰岛细胞的分离和纯化过程复杂，操作中需注意每个细节。⑵本研究首次用组织液体外培养胰岛细胞，证实这种培养液比最常用的含10%FBS的RPMI1640培养液（葡萄糖11mM）更利于维持细胞存活及功能，且组织液作为天然的细胞赖以生存的环境，用组织液体外培养胰岛细胞能更好的研究胰岛细胞生理病理的变化。⑶本研究首次对这种扩散型装置内组织液中葡萄糖与血糖的关系进行研究，发现硅胶室内组织液中葡萄糖的变化能反应血糖的变化，只是在血糖短时间内剧烈升高时，组织液中葡萄糖升高时间上相对滞后于血糖；而室内胰岛素通过特定途径可以调控全身血糖。⑷本研究得出血管化的胰岛与依靠营养物质扩散存活的胰岛在调控糖代谢方面的差异，血管化的胰岛能及时的对血糖升高做出反应，而扩散装置内的胰岛在血糖剧烈升高时，反应时间存在滞后性，而这种滞后的原因与其所处环境中葡萄糖浓度升高滞后有关，而胰岛素的作用过程不存在任何滞后。⑸在体硅胶室中进行胰岛移植具有潜在的临床应用价值。