ECM蛋白SRPX2对结肠癌SW480细胞生物学行为的影响

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目的检测细胞外基质(ECM) SRPX2蛋白在结肠癌组织中的表达,观察过表达SRPX2对结肠癌SW480细胞增殖、侵袭及迁移的影响。方法采用免疫组化(Envision二步法)在结肠癌组织芯片中检测SRPX2的表达。根据Oncomine数据库分析后,选择HCT116、HT29、SW480结肠癌细胞株,采用实时荧光定量PCR技术,筛选出相对高表达SRPX2 mRNA的HCT116细胞;提取总RNA, RT-PCR扩增该基因CDS区的cDNA片段,将PCR产物经DNA测序进行鉴定正确后,通过基因重组技术将该测序正确的目的cDNA片段与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接,构建pcDNA3.1-SRPX2重组真核表达质粒,经双酶切电泳分析鉴定;以脂质体介导瞬时转染相对低表达SRPX2基因的结肠癌细胞株SW480,采用实时荧光定量PCR及蛋白免疫印迹技术鉴定SRPX2mRNA及蛋白的表达;通过细胞增殖实验MTT法,Transwell细胞侵袭、迁移实验检测转染pcDNA3.1-SRPX2重组真核表达质粒后对结肠癌细胞的增殖、侵袭及迁移的影响。结果免疫组织化学检测结果示SRPX2在结肠癌中表达较癌旁组织明显增强(p<0.01);实时荧光定量PCR及Western blot验证了SRPX2 mRNA和蛋白在结肠癌的表达水平,HCT116最高、H29次之、SW480最低;通过T-PCR成功克隆了SRPX2的cDNA片段,经酶切电泳及DNA测序验证,插入的序列与GenBank (NM 014467)上的SRPX2基因mRNA序列完全相符,将目的cDNA片段与载体DNA片段酶切连接后成功构建重组表达质粒pcDNA3.1-SRPX2,双酶切鉴定符合预期,以脂质体(Lipofectamine2000)为介导瞬时转染SW480细胞,实时荧光定量PCR和Western blot检测结果示重组表达质粒pcDNA3.1-SRPX2瞬时转染细胞株中SRPX2 mRNA水平和蛋白水平的表达明显高于空载体及未转染组细胞(p<0.01、p<0.05), pcDNA3.1-SRPX2在结肠癌细胞中可正确表达。MTT(噻唑蓝)细胞增殖实验,结果显示:48h及72h转染重组质粒组细胞的增殖水平明显增高(p<0.05), Transwell实验检测结果表明转染重组质粒pcDNA3.1-SRPX2组细胞的侵袭、迁移能力明显增强(p<0.01)。结论SRPX2在结肠癌组织中表达增强,通过瞬时转染pcDNA3.1-SRPX2后可增强结肠癌SW480细胞的增殖、侵袭和迁移能力,可能起到促进肿瘤发生、发展的作用。
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