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甘露糖受体(Mannose receptor, MR)是甘露糖受体家族成员之一,属于C型凝集素超家族,是甘露糖受体家族最早被发现的成员,分子量为175kDa。已经发现,甘露糖受体表达于巨噬细胞、肝内皮细胞、淋巴内皮细胞和肾小球系膜细胞上。甘露糖受体是典型的Ⅰ型跨膜蛋白,由胞外区、跨膜区和胞内区组成。其胞外区含有三个结构域,由N端起依次为富含半胱氨酸结构域(Cystein rich, CR)、Ⅱ型纤连蛋白结构域FN和8个连续的C-型凝集素结构域(C-type lectin domain,CTLD )。CR能结合SO4-3-Gal、SO4-3/4-GalNAc为末端的糖配体;FN参与胶原蛋白的结合,特别是胶原蛋白Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ;CRD能结合甘露糖、岩藻糖和N-乙酰葡糖胺为末端的糖配体。甘露糖受体胞内区介导受体的内吞和质膜循环。甘露糖受体能介导内源分子的清除,在病原体的识别、抗原提呈和淋巴细胞的黏附中起重要作用。MR还表达在输入和输出淋巴管上,参与某些淋巴细胞和肿瘤细胞对淋巴组织的黏附过程。L-选择蛋白作为细胞粘附分子,存在于大多数白细胞表面,参与白细胞在淋巴内皮上的滚动、黏附和迁移。体外实验表明L-选择蛋白能与输出淋巴管上的甘露糖受体结合,表达L-选择蛋白的淋巴细胞能通过这种方式输出淋巴组织。某些表达L-选择蛋白的肿瘤细胞可能通过L-选择蛋白与淋巴管内皮上的甘露糖受体相互作用参与肿瘤的淋巴道转移。然而,甘露糖受体与L-选择蛋白相互作用的部位尚未阐明,甘露糖受体与L-选择蛋白的相互作用与肿瘤经淋巴道转移的关系,还有待进一步研究。本实验室的前期工作构建了小鼠甘露糖受体CR结构域或CTLD4-7结构域与人IgG Fc段融合蛋白真核细胞表达载体,转染其至293T细胞中表达,并从培养上清中,纯化得到了重组小鼠甘露糖受体CR结构域与人IgG Fc段嵌合蛋白。目的:本研究将优化小鼠甘露糖受体CR结构域与人IgG Fc段嵌合蛋白在真核细胞的表达条件;从转染的细胞培养基中纯化两种蛋白。利用体外黏附实验和流式细胞仪检测,在蛋白质和细胞水平上研究甘露糖受体与L-选择蛋白之间的相互识别。方法:将构建好的pCDNA3.1/sig-CR-Fc、pCDNA3.1/sig-CTLD4-7-Fc真核表达载体用Lipofectamine 2000转染至真核细胞中(293T或COS-7),通过ELISA和免疫细胞化学的方法鉴定融合蛋白的表达量,并优化表达条件。收集大量转染后的培养基,用Protein A亲和层析纯化融合蛋白,SDS-PAGE和Western Blot鉴定。将纯化后的CR-Fc融合蛋白与稳定表达L-选择蛋白的小鼠肝癌Hepa1-6细胞进行体外黏附实验,Hepa1-6细胞作对照。同时还与小鼠淋巴瘤P388D1细胞、稳定表达L-选择蛋白的Hepa1-6细胞共孵育,流式细胞仪检测CR-Fc融合蛋白与细胞表面的识别。结果:1.优化了CR-Fc融合蛋白在293T细胞中的表达条件,获得了更高效的表达,并且在整个转染过程中未使用血清,SDS-PAGE电泳后,考马斯亮蓝染色后呈单一条带,分子量在50 kDa。2.体外黏附实验证明CR-Fc融合蛋白能促进稳定表达L-选择蛋白的Hepa1-6细胞的黏附。3.流式细胞仪检测表明细胞表面表达的L-选择蛋白能与CR-Fc融合蛋白相互识别。4.免疫细胞化学和Western Blot鉴定,CTLD4-7-Fc融合蛋白成功的在COS-7细胞中表达,为进一步纯化奠定了基础。结论:甘露糖受体CR结构域能与L-选择蛋白相互识别,并能促进表面表达L-选择蛋白的细胞黏附。