论文部分内容阅读
苹果再植病害是影响苹果产业可持续发展的一个主要问题。在调查研究中发现引起再植病害的致病镰刀菌中层出镰刀菌（Fusarium proliferatum）从未报道过，本实验室前期分离得到层出镰刀菌菌株H10，而且经胚根接种试验表明，其致病力较强。本研究以层出镰刀菌菌株H10作为插入突变的原始菌株进行T-DNA插入突变。在建立突变体库之前，对农杆菌介导的转化体系进行了优化，包括孢子浓度，农杆菌OD600值，共培养温度，共培养时间等。然后经过潮霉素和PCR鉴定，外源的T-DNA成功整合到病原菌的基因组中。根据已建立的优化体系得到了包含1109个转化子的突变体库，并且完成所有转化子的单孢分离，并保存。随机选取突变体进行形态观察，并进行产孢分析，并通过胚根接种方法进行致病性测定。取得的研究结果如下: 1、对适合层出镰刀菌菌株H10产孢培养基进行筛选，包括CYM、VBC、ATCC、BPY和TYG，结果发现在BPY培养基上接种96 h后产孢达到102.33×105个/mL，240 h后达到306.83×105个/mL，BPY产孢量能够保证试验对孢子的需求量，因此把BPY作为促进产孢的培养基。 2、H10对潮霉素敏感性测定表明，在含有100μg/mL潮霉素的培养基上H10菌株的菌丝及孢子都不能生长，确定筛选潮霉素浓度为100μg/mL。 3、对抑制农杆菌生长的头孢霉素浓度进行筛选，发现200μg/mL浓度能够完全抑制农杆菌生长。 4、大规模构建突变体库前，对转化的体系进行优化，优化后的体系转化效率明显提高。优化后的最佳条件为:农杆菌浓度OD600为0.3，孢子悬浮液浓度为107个/mL，共培养时间为48 h，共培养温度为26℃，AS浓度为600μ mol/mL。 5、经潮霉素和PCR鉴定，突变菌株在含有100μg/mL潮霉素的培养基上能够生长，PCR能够扩增出目的条带，连续转接5代并回接到含潮霉素的培养基上能够稳定遗传，表明外源基因已经插入基因组中。 6、对得到的突变体随机挑选，进行形态、产孢量、致病性等进行测定，菌株颜色大都发生变化，产孢量及形态发生改变，致病性也减弱。