研究背景：肺癌尤其是非小细胞肺癌是最常见的肺原发性恶性肿瘤。近50多年来,世界各国特别是工业发达国家,肺癌的发病率和病死率均迅速上升,死于癌病的男性病人中肺癌已居首位。目前,综合治疗方案已使疗效有所提高,但肺癌5年生存率仍不足20%,肿瘤的侵袭和转移是肺癌患者死亡的主要原因,因此探讨与肿瘤侵袭和转移相关分子有着十分重要的意义。HAb18G是在研究肝癌过程中发现的一个新的细胞表面黏附分子,经GenBank数据库查询,证实为CD147家族新成员,它具有介导细胞黏附、运动、诱导MMPs产生、血管生成、信号转导、逆转纤维化、激活糖酵解、抗肿瘤耐药等许多重要功能和作用。已有文献报道HAb18G分子在肝癌、乳腺癌、前列腺癌和食管癌高表达提示患者的预后不良。尽管也有学者对CD147在非小细胞肺癌表达和预后做出了分析,但对其是否能作为判断非小细胞肺癌预后的独立因素观点却不一。那么作为CD147家族新成员,HAb18G与非小细胞肺癌临床病理特征和预后关系如何?HAb18G除了具有CD147家族分子的一般功能作用,除此之外,有没有其他新的作用?虽然以往学者也注意到HAb18G表达主要定位于胞膜或胞浆,但是他们忽略了这种不同的定位方式与患者临床病理特征和预后的关系,且以往对HAb18G在组织中的表达多以定性研究为主,其定量特点如何?这些问题目前尚未见文献报道,为此我们进行了研究。大量多研究表明MMPs是参与破坏细胞外基质的主要作用者,在肿瘤的侵袭和转移中发生了重要作用,而MMP-2、MMP-9是与肺癌发生发展关系最为密切的基质金属蛋白酶。癌细胞的生长、转移依赖新生血管的形成,血管内皮生长因子(VEGF)是最有效的促血管生长因子。有研究表明在人肝癌细胞中HAb18G/CD147的高表达可以诱导MMPs分泌和活化,在乳腺癌细胞中该基因过表达可以引起MMP-9和VEGF的升高。在肺癌组织中,有研究表明CD147与MMP-2在蛋白水平呈正相关。那么在肺癌细胞中HAb18G与MMP-2、MMP-9和VEGF在mRNA水平是否也遵循相似的规律?HAb18G作为一种新的基质金属蛋白酶诱导剂其对肺癌周围成纤维细胞分泌MMP-2和MMP-9有无影响?此外,HAb18G对肺癌细胞A549生物学行为如迁移、增值和凋亡能力有何影响?这些都是有待探讨的问题。本课题组前期实验结果表明PTEN(10号染色体丢失的磷酸酶基因及张力蛋白同源物,Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten)蛋白表达的缺失与肺癌发生发展有一定的关系。那么PTEN与HAb18G在非小细胞肺癌中有无相关关系呢,这也是本课题研究的内容之一基于以上分析,本课题主要从定量和半定量角度,结合HAbl8G在非小细胞肺癌中的定位情况揭示其在非小细胞肺癌中的表达特点及变化规律,分析其在非小细胞肺癌中的预后意义,并结合课题组前期实验分析PTEN和HAb18G在非小细胞肺癌组织中的表达规律并探讨二者相互关系。此外,我们利用RNA干扰技术,探讨HAb18G与MMPs和VEGF的关系,从细胞水平进一步探讨HAb18G对肺癌细胞迁移、增殖、凋亡的影响。目的：1.结合HAb18G在非小细胞肺癌中的定位情况,定量分析其在非小细胞肺癌中表达特点及变化规律,并分析其在非小细胞肺癌预后中的意义；2.结合课题组前期实验结果分析PTEN与HAb18G在非小细胞肺癌中的相关关系；3.初步探讨HAb18G对其下游基因MMP-2、MMP-9及VEGF的影响；初步探讨HAb18G对肺癌细胞A549和成纤维细胞共培养的影响；4.初步探讨HAb18G对肺癌细胞A549迁移、增值和凋亡能力的影响。材料和方法：1.HAb18G在正常肺组织、非良性病变及非小细胞肺癌中的定量表达特点及其与非小细胞肺癌患者临床病理特征的关系用免疫组织化学SP方法检测HAb18G蛋白在41例相对正常成人肺组织、19例肺部良性病变和208例非小细胞肺癌的表达,用Imageproplus图像分析技术测试HAbl8G蛋白的阳性单位(Positive Unit, PU),分析不同类型肺组织中HAb18G蛋白表达强度的变化规律,及其表达高低水平和不同定位情况分别与非小细胞肺癌临床病理特征之间的关系。2.半定量结果的判断采用半定量判断对有随访资料的136例病人进行生存分析。根据染色程度和染色细胞所占百分比进行评分,半定量判定：阴性(无阳性着色)或弱阳性(+或者++,细胞着色范围<30%)判断为低表达；中等强度阳性(++,细胞着色范围≧30%或者+++,细胞着色范围<50%)或者强阳性(+++,细胞着色范围>50%)判断为高表达。3.应用实时荧光定量PCR (quantitive real time PCR, qRT-PCR)方法、免疫组化检测肺癌细胞HAbl8G的表达情况,选择表达较高者进行RNA干扰。4.用qRT-PCR和Western blot检测SiRNA干扰HAbb18G后其下游基因MMP-2、MMP-9和VEGF的变化。5.用qRT-PCR检测肺癌细胞A549与成纤维细胞共培养后MMP-2和MMP-9的变化。6.划痕实验、MTT增值实验和TUNEL凋亡实验检测HAbl8G对肺癌细胞生物学行为的影响。7.统计分析用SPSS13.0软件进行统计学分析。两样本均数间的比较采用独立样本t检验,配对样本均数间的比较采用配对样本t检验。多样本均数间的比较采用方差分析,若方差齐,组间多重比较采用LSD；若方差不齐,组间的多重比较采用Dunnett’s T3检验。非双变量正态分布资料的相关分析采用Spearman相关系数法。五年生存率的比较采用Pearson χ2检验,用Kaplan-Meier (?)去进行单因素生存分析,差异显著性检验采用log rank检验,多因素生存分析采用Cox风险比例模型方法分析。结果：一、HAb18G蛋白在非小细胞肺癌中的表达情况HAb18G在非小细胞肺癌组织中的表达主要定位于肺癌细胞膜或浆,为粗细不等的棕褐色颗粒,其在肺鳞癌角化珠中低表达或不表达；其在正常肺组织及肺良性病变中几乎不表达,在支气管扩张的粘膜上皮细胞及管壁腺体上皮细胞中有少量表达。在208非小细胞肺癌患者中,35例低表达(16.8%),173例高表达(83.2%)；94例膜表达为主(45.2%),包括51例鳞癌,33例腺癌,10例大细胞癌；81例浆表达为主(51.0%),包括39例鳞癌,62例腺癌和5例大细胞癌；8(3.8%)例无阳性着色,包括7例腺癌和1例大细胞癌。非小细胞肺癌组织中HAb18G的PU值高于正常肺组织和肺良性病变中的PU值(t=-25.34,P=0.000)；正常肺组织和肺良性病变中的PU值基本相同(t=-1.43,P=0.158)；在208例不同组织类型的非小细胞肺癌中,PU值存在差异(F=8.51,P=0.000),其中肺鳞癌PU值大于肺腺癌(P=0.000),肺鳞癌和肺大细胞癌、肺腺癌和肺大细胞癌中HAb18G蛋白PU值基本相同,差异均无统计学意义(P=0.407和P=0.171)。在200例有着色的HAb18G蛋白定位情况中,膜表达的HAb18G蛋白PU值高于浆表达的PU值(t=8.76,P=0.000)。在膜表达组别中,不同类型的非小细胞肺癌组织中PU值存在差异(F=4.08,P=0.02),其中鳞癌的PU值分别高于腺癌和大细胞癌的PU值(P=0.025和P=0.027),腺癌和大细胞癌的PU值无显著性差异(P=0.464)；在浆表达组别中,鳞癌,腺癌和大细胞癌PU值无显著性差异(F=5.23,P=0.085)。二、HAb18G在不同腺癌亚型中表达情况HAb18GPU值与不同的肺腺癌亚型有关(F=34.45,P=0.000),其在贴壁为主型、乳头为主型、腺泡为主型、微乳头型、实体为主伴粘液形成型腺癌中表达依次升高。三、HAb18G表达水平和定位情况与非小细胞肺癌患者临床病理特征的关系在该蛋白表达水平方面,中至低分化肺鳞癌和肺腺癌癌HAb18G蛋白PU值明显高于高分化癌,差异具有统计学意义(t=-5.26,P=0.000)；肺癌TNM分期Ⅰ期、Ⅱ-Ⅲ期、Ⅳ期HAb18G蛋白PU值依次升高,两两比较差异具有统计学意义(F=22.47,P=0.000)；有淋巴结转移的肺癌原发灶中HAb18G蛋白的PU值高于无淋巴结转移的原发灶,差异有统计学意义(t=-2.45,P=0.015)；原发灶HAb18G蛋白PU值与相应转移灶基本相同,差异无统计学意义(t=-0.34,P=0.74)；该蛋白有远处转移的原发灶表达水平大于无远处转移之原发灶(t=-5.58,P=0.000)；男性患者HAb18G PU值的水平高于女性患者(t=2.21,P=0.028)；肿瘤最大直径>5cm的肺癌组织PU值大于肿瘤最大直径≦5cm的肺癌组织(t=-4.44.P=0.000)；有吸烟史的患者高于无吸烟史的患者(t=-2.71,P=0.007)；中央型肺癌高于周围型(t=3.88,P=0.000)。HAb18G PU值与非小细胞肺癌患者年龄无关(t=1.08.P=0.280)。200例有着色的HAb18G蛋白定位情况与临床病理特征关系的分析结果显示,膜表达组别中,HAb18GPU值与分化程度有关(t=-3.26,P=0.002)；胞浆和胞膜的表达水平均与肿瘤的分期(分别t=5.79,P=0.004；t=7.72,P=0.000)和远处是否转移有关(分别t=-2.71,P=0.014；t=-3.46,P=0.001)。该蛋白的定位均与患者的其他临床病理特征无关(P>0.05)。四、HAb18G表达水平和定位情况与非小细胞肺癌患者预后的关系本研究中136例非小细胞肺癌患者的5年总体生存率为30.9%(42/136)。HAb18G低表达和高表达的五年生存率分别为75%(18/24)和21.4%(24/112)(χ2=26.57,P=0.000)。Kaplan-Meier分析结果显示136例非小细胞肺癌中HAb18G高表达患者的总体生存情况显著低于HAb18G (?)低表达患者(P=0.000.log rank检验)。HAb18G在鳞癌和腺癌中表达越高,患者的生存时间也越短(分别P=0.001,P=0.003, log rank检验)。在TNMⅠ和TNM Ⅱ-Ⅲ, HAb18G表达越高,提示患者预后越差(分别P=0.001, P=0.01, log rank检验)。HAb18G在无着色组、浆定位、膜定位组别中,患者五年生存率分别为85.7%(6/7),45.2%(33/73)和5.4%(3/56),三组比较差异具有统计学意义(χ2=33.97,P=0.000)。Kaplan-Meier分析结果显示136例非小细胞肺癌中HAb18G胞膜表达患者的总体生存时间显著低于胞浆表达(P=0.000, log rank检验)。此外,无论是鳞癌还是肺腺癌中,HAb18G胞膜表达患者的总体生存时间均显著低于胞浆表达的总体生存时间(分别P=0.000, P=0.004, log rank检验)。五、Cox风险比例模型多因素分析将患者年龄、性别、吸烟史、肿瘤大小、大体类型、分化程度、淋巴结转移、远处转移、TNM分期、HAb18G的表达及定位全变量做Cox模型多因素分析,结果表明淋巴结转移、远处转移、HAb18G表达和定位情况是均是影响总体生存时间的独立预后因素(分别P=0.019,P=0.000,P=0.000,P=0.003)。最终选择的四个变量模型结果提示淋巴结转移、远处转移、HAb18G表达和定位情况是均是影响患者总生存期的独立预后因素(分别P=0.012,P=0.000,P=0.000,P=0.001)。六HAb18G受试者工作特征曲线(ROC)HAb18G的ROC曲线的面积为0.989,HAb18G蛋白PU值用于区别非小细胞肺癌与非肺癌肺组织有显著性意义(P=0.000)。七、PTEN和HAb18G在非小细胞肺癌组织中的表达及其相关性分析PTEN蛋白在非小细胞肺癌组织中表达的阳性强度明显低于肺部良性病变和正常肺组织(t=4.67,P=0.000),其表达水平与组织分化程度、淋巴结转移及TNM分期均无关(P>0.05),周围型大于中央型(t=2.46,P=0.016)。HAb18G蛋白在非小细胞肺癌组织中表达的阳性强度明显高于肺良性病变和正常肺组织(t=-17.37,P=0.000),其表达水平与非小细胞肺癌分化程度、淋巴结转移及TNM分期均有关(P<0.05)。不同类型的肺组织中PTEN和HAb18G蛋白表达之间呈负相关(r=-0.312,P=0.002)。八、HAb18G对肿瘤细胞本身分泌MMP-2、MMP-9和VEGF的影响与空白对照组相比,qRT-PCR结果显示,HAb18G SiRNA干扰48小时后其mRNA下降了94%(t=-92.96,P=0.000),空白对照组、空脂质体组和无关序列组其HAb18G mRNA水平无显著性差异(F=0.511,P=0.610)；MMP-2mRNA水平较对照组下降约62%(t＝-10.92,P=0.000)；MMP-9mRNA水平较对照组下降70%(t=-7.27,P=0.000)；VEGF mRNA(?)水平较对照组下降约94%(t=-45.32,P=0.000)。Western blot结果显示SiRNA干扰48h后,HAb18G蛋白水平较对照组下降40%(t=58.55,P=0.000),MMP-2蛋白水平较对照组下降34%(t=27.23,P=0.000)MMP-9蛋白水平较对照组下降31%(t=28.64,P=0.000),VEGF蛋白水平较对照组下降35%(t=27.25,P=0.000)。九、HAb18G对肺癌细胞和成纤维细胞共培养后的影响对照组A549细胞和(?)SiHAb18G A549细胞与成纤维细胞共培养后所分泌的MMP-2分别较单独培养时增高56%(t＝-174.20,P=0.000)和77.36%(t=-426.03,P=0.000)；对照组A549细胞与成纤维细胞共培养后较SiHAb18G A549细胞与成纤维细胞共培养所分泌的MMP-2增高约57%(t=-178.16,P=0.000)；对照组A549细胞和(?)SiHAb18G A549细胞与成纤维细胞共培养后所分泌的MMP-9分别较单独培养时增高79%(t=-199.16,P=0.000)和91.67%(t=-311.81,P=0.000)；对照组A549细胞与成纤维细胞共培养后较SiHAb18G A549细胞与成纤维细胞共培养所分泌的MMP-9增高约40%(t=-71.39,P=0.000)。十、HAb18G对肺癌细胞迁移、增殖和凋亡能力的影响在划痕后的第0h-48h动态记录观察不同处理组A549细胞的迁移情况,24h结果显示,与阴性对照组相比,干扰组的A549细胞迁移距离和数量开始下降。与对照组相比,48h后干扰组的A549细胞迁移距离和数量开始明显下降,干扰组迁移距离小于无关序列对照组(t=11.39,P=0.000),干扰组细胞迁移数目小于无关序列对照组(t=36.22,P=0.000)。MTT结果显示,干扰组A549细胞增殖能力在24h、48h和72h较空白对照组分别下降了40.15%,44.32%,42.52%(P<0.05),干扰组A549细胞增殖能力在24h、48h和72h较阴性对照组分别下降了41.00%,43.72%,41.98%(P<0.05)。空白对照组和无关序列组增殖能力均基本相同(P>0.05)。Ki67蛋白水平在干扰组中也显著下降(t=17.14,P=0.000)。Tunel凋亡实验显示,与对照组相比,干扰组细胞凋亡数目显著增多,对两组凋亡图片进行图像分析,干扰组凋亡强度,即光密度OD值显著高于对照组凋亡强度(t=-8.85,P=0.000)。结论：1. HAb18G表达水平与非小细胞肺癌患者的性别、吸烟史、肿瘤直径大小、分化、分期、淋巴结转移和远处转移有关。HAb18G表达与肺腺癌亚型有关。HAb18G表达水平越高,患者的预后越差。膜定位的HAb18G表达与分化有关；膜定位和浆定位的HAb18G表达均与TNM分期和远处转移有关；HAb18G细胞膜表达提示患者预后较差。Cox多因素回归模型分析显示淋巴结转移状况、远处转移状况、HAb18G表达水平和细胞定位是影响患者生存的独立预后因素。ROC曲线提示HAbl8G蛋白PU值用于诊断非小细胞肺癌有较高的价值。2. HAb18G与PTEN呈负相关,PTEN的低表达或缺失,可能与HAb18G的异常激活有一定关系,从而对肺癌的发生、发展起重要作用。3. HAb18G可能通过促进肿瘤细胞本身MMP-2、MMP-9和VEGF的表达促进肿瘤的发生发展,它还可以促进周围成纤维细胞MMP-2和MMP-9的表达进一步促进肿瘤的发生发展。4. HAb18G具有促进肺癌细胞迁移、增殖和抑制肿瘤细胞凋亡的能力。