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目的: 通过研究氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)对血管平滑肌细胞(VSMCs)脂质沉积与细胞转型的影响,探究转录因子FoxO1在ox-LDL对平滑肌细胞的调控过程的作用,观察ox-LDL对FoxO1 DNA甲基化水平的影响,分析FoxO1启动子区DNA甲基化对平滑肌细胞脂质沉积的机制,阐明ox-LDL经FoxO1促进VSMCs脂质沉积与表型转换的机制。 方法: 采用平滑肌细胞作为实验材料,复制平滑肌细胞脂质沉积模型,先将细胞分为三组:空白对照组(0μg/ml )、ox-LDL干预组(50μg/ml、100μg/ml),ox-LDL干预48h,油红O染色确定模型制备成功,观察平滑肌细胞脂质沉积情况,酶法检测各组细胞中总胆固醇(total cholesterol,TC)和甘油三酯(triglyceride,TG)的含量;qRT-PCR和western blot检测各组平滑肌细胞中FoxO1、smoothelin和CON1表达水平;转染FoxO1的过表达(Ad-FoxO1)腺病毒载体,荧光显微镜下观察并验证其转染效率,qRT-PCR和western blot验证过表达FoxO1后自身的mRNA及蛋白的表达;过氧化物酶法检测TC、TG含量的变化;油红O验证各组平滑肌细胞中脂质颗粒是否增加;生物信息学方法分析FoxO1基因启动子区CPG岛分布,nMSP检测各组平滑肌细胞中FoxO1的甲基化水平;用10μmol/L的甲基化抑制剂5-杂氮脱氧胞苷(AZC)干预细胞48h,酶法检测各组细胞中TC、TG的含量改变;qRT-PCR和western blot检测各组平滑肌细胞中smoothelin和CON1的表达改变,明确甲基化对表型转化的影响。 结果: 1.平滑肌细胞油红O染色结果显示:50μg/ml ox-LDL干预平滑肌细胞后,胞质内被红色脂质颗粒充满,形状如脂滴,胞核被染成深蓝色,与对照组和100μg/ml ox-LDL组相比,细胞内脂质颗粒增多。过氧化物酶法检测ox-LDL干预细胞结果显示:与正常对照组相比,50μg/ml ox-LDL组TG、TC含量分别升高了1.34和1.2倍(P<0.001),100μg/ml ox-LDL组TG、TC含量分别升高了0.6和0.3倍(P<0.05)。提示:ox-LDL可以促进胆固醇在平滑肌细胞内的聚积。 2.qRT-PCR和western blot检测不同浓度ox-LDL干预平滑肌细胞48h,平滑肌细胞的smoothelin和CON1随着干预浓度的增加,表达发生改变。与对照组相比,50μg/ml ox-LDL组smoothelin的mRNA和蛋白分别下降31%和58%(P<0.05),100μg/ml ox-LDL组的mRNA和蛋白表达下降46%和68%(P<0.05)。与对照组相比,50μg/ml ox-LDL组CON1的mRNA和蛋白表达分别增高0.5倍和4.1倍(P<0.05),100μg/ml ox-LDL组的mRNA和蛋白表达分别上升0.7倍、6.3倍(P<0.05)。 3.qRT-PCR和western blot检测结果显示:当50μg/ml ox-LDL刺激平滑肌细胞48h时,FoxO1 mRNA相对表达量较对照组升高1.3倍(P<0.01),蛋白表达趋势与FoxO1 mRNA 表达趋势相一致,升高0.9倍(P<0.05)。与50μg/ml ox-LDL相比,100μg/ml组FoxO1mRNA和蛋白表达下降0.39和0.65倍,差异具有显著性(P<0.01)。 4.为明确FoxO1在ox-LDL介导平滑肌细胞内胆固醇聚积中的作用,采用FoxO1的过表达(Ad-FoxO1)转染平滑肌细胞48h,并在荧光倒置显微镜下观察转染效率,镜下可见:转染Ad-GFP组与Ad-FoxO1组内可见大量的绿色荧光蛋白,空白对照组无荧光蛋白。实时荧光定量PCR和western blot检测过表达FoxO1基因后其mRNA及蛋白的表达。结果显示,与正常对照组、空对照病毒(Ad-GFP)组相比,转染Ad-FoxO1腺病毒的平滑肌细胞内的FoxO1基因mRNA及蛋白的表达显著上调,差异有明显的统计学意义(P<0.05)。 5.用Ad-FoxO1转染平滑肌细胞后用50μg/ml ox-LD干预48h,油红O结果显示:与50μg/ml ox-LDL组相比较,Ad-FoxO1组细胞的胞质内红色脂质颗粒明显增多;酶法检测结果显示:与正常对照组相比,Ad-FoxO1组TG和TC的含量分别增加1.4和1.9倍(P<0.01)。与50μg/ml ox-LD相比,Ad-FoxO1组TG和TC的含量上升了60%和63%(P<0.01)。 6.在生物信息网站预测FoxO1的CPG岛,nMS-PCR法检测比较平滑肌细胞在ox-LDL干预下FoxO1启动子甲基化表达情况,结果显示:与正常对照组相比,50μg/ml ox-LDL组FoxO1甲基化水平下降26%(P<0.05),其蛋白水平上升了1.3倍(P<0.05)。给予甲基化抑制剂AZC(10μmol/L)培养48h,甲基化分析和western blot结果显示:AZC可抑制FoxO1启动子区甲基化水平,与对照组和50μg/ml ox-LDL组比较,AZC组的FoxO1甲基化水平分别下降50%和33%(P<0.01,P<0.05),其蛋白分别上升2.4与0.5倍,差异有显著性(P<0.01,P<0.05)。 7.甲基化抑制剂AZC(10μmol/L)干预50μg/ml ox-LDL的平滑肌细胞48h,酶法结果显示:与对照组相比,AZC组的TG、TC含量分别升高1.6和1.2倍(P<0.01);与50μg/ml ox-LDL组比较,TG、TC含量升高50%和49%(P<0.05)。结果表明:FoxO1甲基化水平越低,脂质沉积越明显。 8.qRT-PCR和western blot检测甲基化抑制剂AZC抑制平滑肌细胞后smoothelin和CON1表达改变,检测结果显示:与正常对照组和50μg/ml的ox-LDL相比,AZC组smoothelin的mRNA与蛋白明显下降(P<0.05),CON的mRNA与蛋白上升(P<0.05),差异有显著性。 结论: ox-LDL促进平滑肌细胞脂质沉积,诱导细胞发生成骨样转化现象的发生,是通过上调了平滑肌细胞内FoxO1 DNA甲基化水平实现的,这可能是ox-LDL致平滑肌细胞脂质聚积并最终诱导血管钙化的重要机制之一。