反刍动物生产在食品安全防御中起着重要作用,其瘤胃微生物发酵能将人类不可食用的低品质植物木质纤维成分转化为高品质蛋白质食品肉和奶。反刍动物瘤胃微生物主要包括细菌、古菌、真菌和原虫等,是反刍动物瘤胃发酵的基础,因此,调控瘤胃微生物组成,进而改善瘤胃功能是提高反刍动物生产的有效途径。解析复杂瘤胃微生物组成与其功能之间的联系,可为调控瘤胃功能提供更科学合理的方向和目标。本研究利用宏基因组学技术比较不同类型日粮和北美野牛和安格斯肉牛瘤胃微生物组成和功能之间的差异,并鉴定出与改善瘤胃发酵的差异微生物功能高度相关的主要微生物物种。通过百里香酚调节瘤胃微生物组成的体外发酵试验,进一步验证瘤胃微生物组成变化与瘤胃发酵功能之间的联系。主要试验内容和结果如下:第一部分Kraken2方法的建立及在瘤胃微生物物种分析中的应用验证宏基因组学瘤胃微生物物种分析缺乏专用的数据库及方法,因此,本试验首先以NCBI（RefSeq）中细菌和古菌全基因组序列,以及最新的宏基因组组装基因组序列为基础,建立了专用于瘤胃细菌和古菌物种分析的Kraken2数据库。利用新建立的Kraken2数据库及方法对已发表的宏转录组学数据进行了微生物物种分析,所选宏转录组学数据组中,试验动物为低饲料利用率（low feed efficiency,LFE）和高饲料利用率（high feed efficiency,HFE）的安格斯肉牛各6头。比较分析了新建立的Kraken2方法与原Kraken方法在物种分析上的差异。其主要结果如下:（1）Kraken2方法能注释出序列的比例为72.79%±11.01%,远高于Kraken中31.50%±6.74%。表明新建立的Kraken2方法相比原有的Kraken方法能解析更多的序列信息。（2）Kraken2与Kraken细菌组成差异较小,细菌门水平和属水平上优势菌种较为相似。瘤胃梭菌属（Ruminiclostridium）和嗜线虫致病杆菌属（Xenorhabdus）只在Kraken方法中鉴定到,并且嗜线虫致病杆菌属相对丰度在HFE组中显著低于LFE组（FDR<0.15）。细菌Christensenella属（1.08%）和粪杆菌属（Faecalibacterium）（0.27%）只在Kraken2中鉴定到,并且HFE组中粪杆菌属相对丰度显著高于LFE组（FDR<0.15）。（3）在古菌物种组成上,Kraken2与Kraken在各物种水平优势微生物均差异较大。Candidatus Methanomethylophilus（16.02%）只在Kraken方法中鉴定出,而Kraken2则比Kraken多鉴定出多个古菌属,包括热球菌属（Thermococcus）、甲烷球形菌属（Me thanosphaera）等。（4）Kraken或Kraken2方法中,β多样性显示,不同饲料利用率的动物瘤胃细菌或古菌群落结构均差异不显著（P>0.05）。Kraken2方法中不同饲料利用率组古菌群落结构有一定差异趋势（P=0.092）。小结:本试验中新建立的Kraken2数据库及方法,较之前的Kraken方法在古菌物种分析上具有更高的准确度,因此,Kraken2方法更适用于后续宏基因组学物种分析。第二部分宏基因组学反刍动物瘤胃微生物物种和功能解析本试验采用北美野牛与安格斯肉牛各16头,各随机分为两组,每组8头动物,分别饲喂背景日粮和高谷物日粮,采用宏基因组学技术解析不同动物种类和日粮类型对瘤胃微生物组成和功能分类（SEED subsystems）及碳水化合物活性酶（CAZymes）组成的影响。通过不同数据库中相同的序列ID将差异功能（包括差异CAZymes）与瘤胃细菌和古菌进行对应,采用Spearman相关性分析获得与差异微生物功能高度相关的细菌和古菌种类。其主要结果如下:（1）除14个共有的的细菌门,细菌软壁菌门（Tenericutes,0.58%）仅在安格斯肉牛中出现。除纤维菌门（Fibrobacteres）在安格斯肉牛HG组相对丰度差异显著低于BCK组（FDR<0.05）外,其他细菌门相对丰度均无显著差异（FDR>0.05）。在两种动物中,月形单胞菌属（Selenomonas）和八叠球菌属（Sarcina）均分别在HG日粮组和BCK日粮组中相对丰度更高。此外,日粮类型还显著影响安格斯肉牛中包括纤维杆菌属（Fibrobacter）、另枝菌属（Alistipes）等细菌属相对丰度（FDR<0.05）。同饲喂BCK日粮,两种动物瘤胃细菌差异较小,而同饲喂HG日粮,安格斯肉牛奥尔森菌属、脱硫弧菌属、巨型球菌属等细菌属相对丰度显著高于北美野牛（FDR<0.05）。（2）古菌属水平上,除Candidatus Methanomethylophilus（0.17%）仅在北美野牛瘤胃中鉴定到,其他主要古菌属（相对丰度≥0.5%）在不同类型日粮或动物中差异均不显著。种水平上,日粮类型仅影响安格斯肉牛瘤胃methanogenic archaeon ISO4-H5 和 uncultured euryarchaeote 的相对丰度（FDR<0.05）。同饲喂BCK日粮,北美野牛瘤胃米氏甲烷短杆菌（Methanobrevibacter millerae）、Methanomassiliicoccaceae archaeon DOK和Candidatus Methanomethylophilus alvus相对丰度均显著高于安格斯肉牛（FDR<0.05）,而安格斯肉牛瘤胃中uncultured euryarchaeote相对丰度在BCK或HG日粮条件下均显著高于北美野牛（FDR<0.05）。（3）日粮类型对北美野牛瘤胃微生物SEED subsystems功能影响远小于安格斯肉牛。在北美野牛中,属于level1碳水化合物,辅因子、维生素、辅基和色素和蛋白质代谢中少数level3功能分类等BCK日粮组丰度更高,而属于蛋白质代谢,碳水化合物,和氨基酸及其衍生物等少数level3级别功能在HG日粮组丰度更高。不同于北美野牛,安格斯肉牛主要在HG日粮组有大量level3功能分类丰度显著高于BCK日粮组,这些功能分类主要属于氨基酸及其衍生物,碳水化合物,蛋白质代谢,辅因子、维生素、辅基和色素等level1功能。同饲喂BCK或HG日粮,北美野牛均有更多的level3功能分类丰度显著高于安格斯肉牛。同饲喂BCK日粮,北美野牛瘤胃微生物功能中丰度显著高于安格斯肉牛的level3功能分类主要是属于碳水化合物,氨基酸及其衍生物,以及辅因子、维生素、辅基和色素等,而安格斯肉牛主要是脂肪酸生物合成等功能丰度高于北美野牛。同饲喂HG日粮,在北美野牛中丰度更高的level3功能分类主要属于level1碳水化合物,脂肪酸,脂质和甾体,以及辅因子、维生素、辅基和色素等相关功能,而安格斯肉牛中更丰富的功能主要是蛋白质代谢等功能。（4）日粮类型对北美野牛瘤胃微生物碳水化合物活性酶（CAZymes）和碳水化合物结合模块基因组成影响小于安格斯肉牛,主要体现在安格斯肉牛不同日粮组差异CAZymes和碳水化合物结合模块数目大于北美野牛。两种动物中参与纤维素和半纤维素降解的的糖苷水解酶（GHs）和碳水化合物结合模块（CBMs）均在BCK日粮组更丰富,而参与寡糖降解的CBMs和糖苷水解酶及碳水化合物生成的糖基转移酶（GTs）等均在HG日粮组更丰富。同饲喂BCK日粮,参与半纤维素降解的GH113、CBM61等在北美野牛瘤胃中更丰富,而在安格斯肉牛中更丰富的主要是参与寡糖降解的CBM26、GH24、GH73等。同饲喂HG日粮,北美野牛瘤胃中仍有少数如GH8、GH9等纤维素酶或半纤维素酶,以及少数如CBM6、CBM9等碳水化合物结合模块丰度高于安格斯肉牛,而参与寡糖降解的GH65、GH68和CBM34等在安格斯肉牛丰度更高。（5）本试验对部分微生物进行了一定的功能划分。细菌氨基酸球菌属（Acdaminococcus）、小类杆菌属（Dialister）与甲烷产生相关功能成显著正相关（ρ>0.7,且校正后P<0.001）,而细菌短螺旋体属（Brachyspira）、奥尔森菌属（Olsenella）和巨球型菌属（Megasphaera）与甲烷产生相关功能成显著负相关（p<-0.7,且校正后P<0.001）。细菌另枝菌属（Alistipes）与B族维生素生物合成相对丰度成正相关,细菌Lachnoclostridium属、布劳特氏菌属（Blautia）与氨基酸生物合成相对丰度成正相关。此外,普雷沃氏菌与蛋白质降解相对丰度成正相关。（6）氨基酸球菌属、布劳特氏菌属、Lachnoclostridium属、Roseburia属与参与纤维素或半纤维素降解的碳水化合物结合模块（如CBM1、CBM6、CBM10等）成显著负相关。细菌布劳特氏菌属、Aminipila属与GH45、GH5等纤维素或半纤维素酶成显著负相关。此外,细菌布劳特氏菌属、Anaerostipes属、Lachnoclostridium属、Roseburia属与GH1、GH4等寡糖降解糖苷水解酶成正相关。细菌另枝菌属、布劳特氏菌属、Lachnoclostridium属、Anaerostipes属、Roseburia属与碳水化合物酯酶成正相关。小结:日粮类型对北美野牛瘤胃微生物物种组成和功能特性影响较小,而对安格斯肉牛影响较大。同种日粮北美野牛与安格斯肉牛中瘤胃微生物物种组成和功能特性也有一定差异。结合不同日粮中北美野牛与安格斯肉牛瘤胃微生物在组成和功能特性的差异,北美野牛对粗料日粮的利用中较安格斯肉牛更高效,而北美野牛与安格斯肉牛在高精料日粮中利用模式不同。部分瘤胃微生物物种与影响瘤胃发酵的微生物功能高度相关,调控瘤胃内这些微生物的相对丰度,可有助于改善瘤胃发酵功能。第三部分体外发酵添加百里香酚影响瘤胃发酵功能的研究在第二部分中我们发现细菌布劳特氏菌属、Lachnoclostridium属、Anaerostipes属等细菌与改善瘤胃发酵的微生物功能高度相关。百里香酚是具有抗微生物特性的植物精油的生物活性成分,其可能影响瘤胃微生物组成,并改善瘤胃发酵功能,因此,本试验体外模拟瘤胃发酵,通过外源添加不同浓度（0、100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L）百里香酚添加,探究百里香酚添加对瘤胃细菌、古菌和原虫组成,以及胃发酵功能的影响,通过建立瘤胃内各微生物组分变化与发酵产物产量之间的联系,获得与瘤胃发酵功能高度相关的微生物种类。其主要结果如下:（1）中浓度（200 mg/L）或高浓度（400 mg/L）百里香酚添加能显著降低瘤胃甲烷产量（P<0.05）。高浓度百里香酚添加会抑制瘤胃发酵,显著降低（P<0.05）瘤胃发酵总产气量（Total gas production,TGP）和 IVDMD、IVOMD,以及显著提高乙酸/丙酸比值（P<0.05）。中浓度或高浓度百里香酚添加显著降低瘤胃异丁酸和戊酸产量（P<0.05）。（2）百里香酚添加显著影响瘤胃细菌组成,门水平上,中浓度或高浓度百里香酚添加显著降低拟杆菌门（Bacteroidetes）相对丰度（P<0.05）,而同时显著升高厚壁菌门（Firmicutes）相对丰度（P<0.05）。属水平上,中浓度或高浓度百里香酚添加均显著降低普雷沃氏菌属（Prevotella）和Veillonellaceae UCG-001属相对丰度（P<0.05）相对丰度,而显著提高链球菌属（Streptococcus）、假丁酸弧菌属（Pseudobutyrivibrio）等细菌属的相对丰度。（3）百里香酚对瘤胃古菌的影响远小于细菌。种水平上,与对照组相比,中浓度或高浓度百里香酚添加显著降低了 unclassifiedfMethanomassiliicoccaceae的相对丰度（P<0.05）,高浓度百里香酚添加显著提高了unclassified cMethanomicrobia 相对丰度（P<0.05）。（4）百里香酚的瘤胃原虫组分的影响较瘤胃古菌更小。与对照组相比,不同浓度百里香酚添加对瘤胃原虫科水平上或属水平均无显著影响。（5）瘤胃细菌、古菌和原虫微生物相对丰度与瘤胃发酵产物参数之间的Spearman相关性分析显示,细菌乳杆菌属、假丁酸弧菌属、链球菌属、Ruminococcaceae V9D2013 group 属、Ruminococcaceae UCG-002 属、琥珀酸弧菌属、unclassifiedfPrevotellaceae属和脱硫弧菌属,以及瘤胃原虫等毛虫属与甲烷产生和VFA产量等功能具有显著相关性（p>0.70或<-0.70,且FDR<0.005）。小结:200 mg/L百里香酚添加对瘤胃微生物仅影响少数瘤胃微生物组成,可一定程度促进瘤胃发酵,400 mg/L百里香酚添加可影响多数瘤胃微生物的丰度组成,并抑制瘤胃发酵。本试验主要发现部分微生物类型可通过降低瘤胃甲烷产量和提高瘤胃VFA产量,进而改善瘤胃发酵功能。综上所述,本研究主要得出以下结论:1.新建立的瘤胃微生物物种分析数据库及Kraken2方法,不仅从算法优化上大大提高了物种分析效率,同时从数据库改进上提高了物种分析准确度,是更为可靠和高效的宏基因组学物种分析方法。2.日粮类型对北美野牛瘤胃微生物组成和功能特性的影响较小,而对安格斯肉牛影响较大。同种日粮北美野牛和安格斯肉牛瘤胃微生物组成和功能特性也存在一定差异。结合瘤胃微生物物种和功能特性在不同日粮和动物种类中的差异,相较安格斯肉牛,北美野牛对粗料日粮有更高利用率,且两种动物对高精料日粮有不同利用模式。3.外源添加200 mg/L百里香酚能显著降低瘤胃甲烷产量,对瘤胃细菌、古菌和原虫无明显不利影响,且能维持瘤胃正常发酵功能,而高浓度如400 mg/L百里香酚添加则对多数瘤胃微生物及瘤胃发酵有明显抑制作用。4.瘤胃部分微生物物种对瘤胃发酵功能影响较大,适当调控这些瘤胃微生物的丰度,可有助于改善瘤胃发酵功能。