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利用聚合酶列式反应(PCR)从大肠杆菌中扩增到类铜的特异性启动子CopA和铜调控蛋白CueR基因,以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,pGEM为载体,构建成离子诱导表达质粒CGPNPCT,转化入大肠杆菌DH5α宿主菌体中,加入铜离子诱导表达,测定其对重金属铜及其衍生物的耐受性。
成功制备了抗重金属铜的工程菌株,研究了工程菌株的荧光强度与铜离子浓度和诱导时间的关系,以及工程菌的性质,以考察工程菌株用于快速检测重金属铜的可行性。工程菌株的研究结果如下:
1.以含CGPNPCT质粒的DH5α在无铜诱导时绿色荧光蛋白的表达量为对照,加入Cu2+诱导4h后,测定表达荧光的吸收光谱,可见在480-520nm有吸收峰。
2.工程菌DH5α(CGPNPCT)在培养基中加入不同终浓度的Cu2+诱导4h发现,随着铜离子(Cu2+)浓度的增加,诱导的荧光表达量逐渐上升,铜离子在1.5mmol/L时达到最高值,然后下降,3mmol/L达到平衡,在0~4mmol/L范围内,荧光强度和离子浓度呈正相关。
3.工程菌DH5α(CGPNPCT)在培养基中加入不同浓度的Cu2+做诱导,在0-12个小时的时间段内每两个小时取样测定荧光值,数据显示,荧光值随Cu2+浓度增大呈明显上升趋势。铜离子(Cu2+)浓度相同时,随着时间梯度的变化,荧光值稳定上升,与时间呈正比。
4.分别采用6种重金属离子(Cu2+、As5+、Cd2+、Cr3+、Hg2+、Pb2+)对工程菌株进行诱导,测定荧光强度考察工程菌株对铜离子的特异性。发现,工程菌株对铜以外的重金属离子基本没有响应,说明工程菌株对铜离子具有较强的特异性。
上述结果表明,以绿色荧光蛋白基因为报告基因的工程菌株DH5α(CGPNPCT)有望建立起一种方便快捷的重金属铜的检测方法-微生物全细胞传感器法,具有很高的应用价值。