论文部分内容阅读
目的基于第二代高通量测序技术筛选脾肾阳虚型溃疡性结肠炎大鼠结肠组织差异表达基因,观察脾肾阳虚型溃疡性结肠炎大鼠的趋化因子信号通路中CXCL1、CXCL2、CXCR2、CXCL6、CCL7、CCL12等趋化因子的基因和基质金属蛋白酶MMP3、MMP8、MMP13在结肠组织中表达的变化,以及温补脾肾法方药对以上因子表达的影响,筛选脾肾阳虚型UC的特异性靶点,并作为诊断标志物、治疗效果及预后判断的客观化指标。6方法SPF级Wistar大鼠96只雌雄各半分开按照随机数字表法分空白组、模型组、中药高、中、低剂量组、SASP组雌雄各8只,除外空白组,其余各组造模成功后分组给药治疗(模型组不给药)。取材后用肉眼观察结肠组织形态,分别选取空白组大鼠结肠组织与模型组大鼠病变部位结肠组织进行高通量测序,以及基因差异表达分析、差异表达基因GO富集分析和Pathway富集分析,Real Time-qPCR法检测CXCL1、CXCL2、CXCR2、CXCL6、CCL7、CCL12等趋化因子及MMP3、MMP8、MMP13基因的表达,免疫印迹法检测大鼠结肠组织中MMP3、MMP8、MMP13蛋白质的表达。结果1.空白组大鼠与模型组大鼠相应结肠组织基因的差异性表达分析:与模型组大鼠相比较,根据q-value≦0.05,Fold-change≧1.5筛选出空白组大鼠差异表达的基因216个,其中下调166个和上调84个。相对于模型组大鼠大鼠,表达下调的基因明显多于表达上调的基因,表达下调的基因数目是表达上调的1.96(166/84)倍。2.差异表达基因的GO及Pathyway分析:将筛选出来的差异表达基因进行生物过程(biological process,BP)、细胞成分(cellular component,CC)、分子功能(molecular function,MF)三个层次的统计分析,其中BP 3158个、CC 1863个、MF 695个。同时发现相关的信号通路。3.RT-qPCR法检测大鼠结肠组织CXCL1、CXCL2、CXCR2、CXCL6、CCL7、CCL12mRNA相对表达量:与空白组结肠组织比较,模型组中CXCL1、CXCL2、CXCR2、CXCL6、CCL7、CCL12基因表达量明显提高,差异具有统计学意义(P<0.01);与模型组结肠组织相比较,各治疗组中CXCL1、CXCL2、CXCR2、CXCL6、CCL7、CCL12基因表达量明显下降,差异具有统计学意义(P<0.01);与测序结果一致。4.RT-qPCR法检测大鼠结肠组织MMP3、MMP8、MMP13 mRNA的相对表达量:与空白组相比较,模型组结肠组织中MMP3、MMP8、MMP13基因表达上调,具有显著的差异性,差异具有统计学意义(P<0.01);与模型组相比较,各治疗组结肠组织MMP3、MMP8、MMP13基因表达下调,具有显著的差异性,差异具有统计学意义(P<0.01);与测序结果一致。5.免疫印迹法检测大鼠结肠组织MMP3、MMP8、MMP13蛋白质的表达:Western blot法检测结果显示:与空白组相比较,模型组的MMP3、MMP8、MMP13蛋白质相对表达量均增多,具有显著的差异,差异具有统计学意义(P<0.01);与模型组相比较,各治疗组MMP3、MMP8、MMP13蛋白质相对表达量下调,具有显著性差异,差异具有统计学意义(P<0.01);与测序结果一致。结论1.本研究采用的脾肾阳虚型UC大鼠病证结合模型具有可行性、合理性及科学性;第二代测序技术是中医客观化研究的重要手段之一。2.脾肾阳虚型溃疡性结肠炎趋化因子信号通路中CXCL1、CXCL2、CXCR2、CXCL6、CCL7、CCL12基因表达显著上调,可作为UC黏膜炎症活动的客观指标。具有温补脾肾功效的理中汤合四神丸复方中药颗粒可以有效下调以上因子的表达。3.温补脾肾法能显著下调脾肾阳虚型UC大鼠结肠黏膜中过度表达的MMP3、MMP8、MMP13基因和蛋白,亦可作为诊断UC的特异性标志物及治疗UC的疗效评估指标。