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TLR4(Toll-like receptor 4)作为一种重要的模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs),在介导脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)跨膜信号转导途径中发挥主导作用,并参与介导由LPS诱导的一系列前炎性细胞因子的合成与释放,进而引发过度炎症反应(Goldammer et al.,2004),在G~-致病机理中有至关重要的作用。现已证实,在人和鼠体内TLR4都是LPS最重要的模式识别受体,作为一种跨膜信号受体,TLR4可将LPS刺激信号直接传入细胞内,在介导革兰氏阴性细菌及LPS的宿主反应中发挥关键作用(Hashimoto et al.,2004)。研究在LPS介导下TLR4基因与胞内炎症因子的变化情况是阐明TLR4基因在抗革兰氏阴性细菌感染的基本途径。本研究选择贵州黔北麻羊为试验对象,根据Gene Bank中山羊TLR4基因序列对其三个外显子分别设计引物,采用PCR结合直接测序法对TLR4三个外显子SNPs进行筛选;通过克隆TLR4基因CDS全长,构建重组真核表达载体pEGFP-N1-TLR4。将重组真核表达载体转染小鼠巨噬细胞(Ana-1),在转染48 h后检测GFP活性并对转染细胞以LPS诱导,在诱导后3、6、9、12、24 h收集细胞上清,Elisa对不同时间段、不同浓度LPS诱导下胞内炎症因子IL-1、IL-6和TNF-α进行检测。研究结果如下:(1)实验对贵州黔北麻羊TLR4基因3个外显子进行了SNPs筛选,共发现3个SNP位点,分别是Intron1 A+212C、Intron1 G+219A、Exon3 C+8209G,其中C+8209G位点引起所编码氨基酸由亮氨酸突变为缬氨酸。(2)实验成功克隆了黔北麻羊TLR4基因CDS全长,构建了重组表达载体pEGFP-N1-TLR4。(3)采用qRT-PCR检测了转染组及正常小鼠巨噬细胞组中的TLR4基因和TLR2基因相对表达量,结果显示TLR4 mRNA表达量在阳性转染组中较TLR2显著提高(P<0.05)。实验通过对转染48 h后的小鼠巨噬细胞分别以0 ng、100 ng、200 ng、500 ng、1000 ng、2000 ng LPS进行诱导,在诱导后3 h、6 h、9 h、12 h、24 h收集细胞上清液,对上清液中IL-1、IL-6及TNF-α3种炎症因子进行了Elisa检测,结果表明:(1)在不同浓度LPS诱导下,IL-1、IL-6和TNF-α分泌量各不相同,当LPS浓度为100 ng、200 ng时,IL-1分泌量较对照组IL-1表达量差异显著(P<0.05),当LPS浓度大于500 ng时,IL-1分泌量较对照组IL-1分泌量差异极显著(P<0.01),并且IL-1的分泌量与LPS呈现出一定剂量依赖性。(2)IL-6分泌量随时间增加而上升,在100 ng LPS刺激下,IL-6分泌量与对照组IL-6分泌量差异不显著(P>0.05),当LPS浓度大于100 ng时,IL-6分泌量与对照组IL-6分泌量差异显著(P<0.05),并且IL-6分泌量仍呈上升趋势。(3)TNF-α在100 ng的LPS诱导下其分泌量在12 h达到最大值,在24 h时TNF-α分泌量降低。并且当LPS浓度为100 ng时,TNF-α分泌量与对照组TNF-α分泌量差异极显著(P<0.01),说明此时细胞内炎症强度最高,即TLR4基因最大程度参与了对LPS的应答反应。随着LPS浓度的升高TNF-α分泌量也下降,与对照组相比差异不显著(P>0.05)。