血管紧张素转换酶的提取与其抑制剂相互作用研究

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血管紧张素转换酶(Angiotensin Cconverting Enzyme,ACE;EC.3.4.15.1)是一种含锌离子的二肽羧基酶,在血压调节中发挥着重要作用。为了研究ACE的生化性质、结构功能以及ACE与抑制剂的结合机理,首先需要制备出高活性、高纯度的ACE。本论文从猪肺中分离纯化得到高纯度的ACE,并研究其酶学性质。运用等温滴定量热技术、紫外-可见光光谱法研究等手段研究猪肺ACE与抑制肽缬氨酸-丙氨酸-脯氨酸(Val-Ala-Pro,VAP)以及苯丙氨酸-缬氨酸-丙氨酸-脯氨酸(Phe-Val-Ala-Pro,FVAP)结合机理,主要内容如下:(1)以新鲜猪肺为原料,经过匀浆、硫酸铵分级盐析、透析以及离子交换层析等分离纯化手段,然后用能大批量处理酶液的超滤膜包对酶液进一步纯化,考察了放大超滤处理过程进样流速、截留液体积、洗涤体积的条件对酶纯化效果的影响,确定了最优条件:超滤流速为5mL·min-1,洗涤液体积为300mL,截留液收集体积20mL。经过一系列纯化后得到电泳级纯度的酶,相比匀浆液纯化倍数为467.6倍,酶活回收率为37.4%,比活为2.15U·mg-1。用SDS-PAGE测定其分子量为180KD,研究了提取的ACE酶催化的最适温度和最适pH,得出酶催化的最适温度为40℃和最适pH为8.3,测得米氏常数为2.54mmol·L-1。(2)用等温滴定量热法测定抑制肽VAP和FVAP的抑制类型,结果表明这两种抑制肽均为非竞争性抑制肽,测得VAP和FVAP的IC50值分别为1.36 μmol·L-1和8.19 μmol·L-1。用等温滴定量热法测定ACE与两种抑制肽结合的热力学参数,测量结果为:VAP与ACE结合的过程结合位点数n,随着温度升高依次增大,结合焓变ΔH随温度的增大,288.15 K时结合的焓变为 12.07 KJ·mol-1,摩尔恒压热容ΔCP 为-0.9810 KJ·mol-1·K-1,熵变值为-19.36 KJ·mol-1,吉布斯自由能改变量为-31.06KJ.mol-1,属于熵焓共同驱动过程;FVAP与ACE结合过程的结合位点数n也随温度升高依次增大,在288.15 K时结合焓为-2.33 KJ.mol-1,热容 Cp 为-0.688 KJ.mol-1·K-1,熵值为-21.35 KJ·mol-1,吉布斯自由能变为-23.68KJ·mol-1,结合常数为2.0×1031/M,熵值明显大于焓值,这是一个熵驱动过程。(3)采用紫外-可见光度法研究抑制肽VAP、FVAP与ACE相互作用过程,其结果为:分别将VAP、FVAP与ACE酶液混合后,发现与没加抑制肽酶液光谱图相比,在230nm发生红移、增色,说明VAP、FVAP与ACE相互结合,且ACE的肽链结构发生改变。
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