里氏木霉与黑曲霉混合发酵产纤维素酶的研究

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农作物秸秆含有的木质纤维素是地球上丰富、廉价的可再生资源,对其进行水解可得到含有葡萄糖、木糖等单糖的混合糖,是潜在的重要生物转化原料。有效开发和利用这些纤维素资源,是缓解我国能源危机、减少工业用粮的有效途径。本文以里氏木霉为出发菌株,采用Co60γ-射线对其进行诱变选育,筛选出纤维素酶高产菌株;利用响应面法优化里氏木霉突变株与黑曲霉菌株混合发酵的条件,并考察纤维素酶酶解木质纤维素物质的效果。主要研究结果如下:1)采用Co60γ-射线对出发菌株里氏木霉进行诱变具有较好的效果。在最佳诱变剂量400Gy下,反复诱变获得34株突变株,经刚果红纤维素培养基初筛、摇瓶复筛获得一株高产纤维素酶的里氏木霉突变株mut-19;该菌株的滤纸酶活(FPA)为1.170IU/mL,较出发菌株提高了10.58%;经斜面转接五代后,突变株mut-19产纤维素酶能力保持稳定。2)采用Box-Behnken响应面法优化了混合发酵产纤维素酶条件,通过Design Expert分析软件建立起回归模型。研究获得的最佳产酶条件为:黑曲霉延迟接种时间36h、里氏木霉与黑曲霉接种比例5:1、发酵时间6d、固液比2:50(g/mL)、Tween-80浓度4mL/L、pH5.0、250mL摇瓶装液量50mL,该条件下FPA达到1.224IU/mL,β-葡萄糖苷酶活(β-GA)达0.315IU/mL;验证试验结果显示其滤纸酶活均落在响应值的95%预测区间范围内,表明该模型能够较好地描述实际产酶情况。3)对纤维素酶粗酶液的酶解反应效果进行考察,获得其最佳酶解反应条件为:温度50℃、pH5、酶解时间5h;该条件下粗酶液酶解经碱性双氧水处理的玉米秸秆,所得还原糖浓度为11.047mg/mL,还原糖得率为16.571%。4)对玉米秸秆、小麦秸秆、油菜秸秆等不同木质纤维素类原料,采用混合发酵纤维素酶粗酶液和市售纤维素酶进行酶解对比试验,结果显示混合发酵纤维素酶酶解液中的还原糖与市售纤维素酶酶解液中的还原糖接近;酶解效果最好的是经碱性双氧水处理的玉米秸秆。5)硫酸铵分级沉淀结果显示,硫酸铵初步分离可以有效增加酶活力,经分级的纤维素酶的最大比活力可达26.286IU/mg,此酶用于酶解经碱性双氧水处理的玉米秸秆,酶解液中木糖含量10.207mg/mL,葡萄糖含量12.365mg/mL,总还原糖含量22.572mg/mL,还原糖得率33.286%,酶解液中不存在纤维二糖,表明混合发酵能够使纤维素酶系更完整。
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