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目的在机体生长过程中细胞周期调控起着关键性的作用,而其进程的失衡也会导致肿瘤的发生与发展,cyclin D-CDK4/6-INK4-Rb为细胞周期调控过程中重要通路,其在头颈部鳞癌中改变非常常见,但细胞周期蛋白依赖激酶4(Cyclin-dependent kinase 4,CDK4)作为该通路中关键性因子之一在头颈部鳞癌细胞中具体生物学行为机制仍不明确,需进一步研究,本实验通过构建带Flag标签的pcDNA3.0载体CDK4基因真核表达载体并初步验证该基因对喉癌细胞(Hep-2)的生物学行为影响,为今后进一步研究喉癌细胞发生发展机理奠定前期基础。方法以人乳腺文库为模板通过聚合酶链反应(PCR)技术扩增出CDK4的CDS区序列,采用双酶切技术将扩增出的CDK4序列插入到带Flag标签的pcDNA3.0载体中,将产物进行DH5α感受态细胞转化,获得阳性克隆菌液并提取质粒转染293T细胞,进行基因蛋白表达和基因测序鉴定,待鉴定结果正确,将pcDNA3.0-Flag-CDK4与pcDNA3.0-Flag真核表达载体进行喉癌细胞(Hep-2)转染,经实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测CDK4基因在喉癌细胞中的转录水平,蛋白印迹实验检测该目的基因蛋白在Hep-2细胞中的表达情况,CCK-8法和平板克隆实验验证该基因对Hep-2细胞增殖影响。结果蛋白表达鉴定和基因测序结果证明pcDNA3.0-Flag-CDK4真核表达载体构建成功,提取质粒转染Hep-2细胞,qRT-PCR检测CDK4基因于Hep-2细胞中转录水平较对照组明显增高,蛋白印迹实验结果显示Hep-2细胞中成功表达目的基因蛋白,上述实验证明目的基因成功转入至Hep-2细胞,CCK-8法和平板克隆形成实验证明CDK4基因可促进Hep-2细胞增殖。结论本实验成功构建人CDK4基因的真核表达载体,并初步验证该基因可促进喉癌细胞(Hep-2)增殖,为进一步研究喉癌细胞发生发展机理奠定前期基础。