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碱性果胶酶(Alkaline polygalacturonate lyase,PGL, E.C.4.2.2.2),是一种广泛应用于纺织工业棉织物煮炼中的酶。为了提高发酵法生产PGL的产量,在前期的研究中从一株PGL高产菌株中扩增出编码该酶的基因,并成功表达于毕赤酵母(P. pastoris) GS115中。本论文在此基础上,通过详尽分析诱导阶段培养基不同pH和甲醇浓度对P. pastoris GS115高效表达碱性果胶酶的影响,提出了pH控制策略和甲醇浓度控制策略,并将两者进行结合,最终实现了PGL的高效生产。在考察培养基pH对PGL生产的影响时,首先将菌体生长阶段的pH控制在5.5,诱导阶段采用不同的pH;在甲醇在线控制策略中,培养基的pH值控制在5.5,诱导阶段通过在线流加不同浓度的甲醇研究甲醇浓度对PGL生产的影响。为了进一步提高PGL的产量,在综合考虑甲醇消耗、最优pH、细胞活力和PGL产量的基础上,把诱导阶段分为两个时期(菌体生长阶段结束至诱导后40 h的诱导阶段称为过渡时期),并将pH控制策略结合甲醇在线控制策略应用于诱导阶段,与恒速流加甲醇相比,该策略使PGL的产量提高了100%,达到1631 U/mL。同时,通过检测细胞活力、AOX酶活和胞内能荷水平等参数,证明了该策略在高效生产PGL的过程中能有效地促进菌体生产PGL的能力。前期的研究成果为:从分离筛选得到的一株碱性果胶酶高产菌株Bacillus sp. WSHB04-02中,扩增出编码碱性果胶酶的基因,并成功表达于P. pastoris GS115中;通过优化培养基成分、采用高密度发酵以及考察甲醇浓度和细胞浓度的比率等因素,使PGL的产量达到800 U/mL。本论文在此基础上对PGL生产的关键因素pH和甲醇浓度进行了以下研究:1)为提高重组P. pastoris GS115发酵生产碱性果胶酶的产量和生产强度,在3 L发酵罐中考察了6个不同的pH(6.5、5.5、4.5、3.5、5、4)对重组毕赤酵母生产PGL的影响。结果发现,在pH为4.5时,PGL产量达到1362 U/mL,细胞干重为144 g/L,发酵结束时,细胞活力仍然可以维持在80%,在整个诱导阶段,培养基中甲醇浓度维持在17 mL/L;而其他pH水平对PGL的生产则没有很明显的促进作用。2)在pH控制策略的基础上,为了研究甲醇浓度对PGL发酵生产的影响,在3 L发酵罐上依次考察了5个不同的甲醇水平(8 mL/L,,12mL/L,16 mL/L,20 mL/L和24 mL/L)对发酵产酶的作用。结果表明,培养基中维持16 mL/L的甲醇浓度最有利于PGL的生产,PGL的产量可以达到1260 U/mL,细胞干重为140 g/L,但是PGL产量仍然稍低于以10 mL/L的速度恒速流加甲醇时的产量。胞内ATP、ADP和AMP的水平分别为1.2 g/L,0.04 g/L ,0. 28 g/L,发酵结束时细胞活力为77%。3)在以上研究的基础上,本论文第一次提出了“过渡时期”的概念,在本研究中,根据菌体的生理特性,将菌体生长阶段结束之后至诱导后40 h之间的一段时间称之为过渡时期。在过渡时期采用pH 5.5和较低的甲醇浓度(12 mL/L)诱导菌体生产PGL,之后的诱导阶段pH设为4.5,分别采用16 mL/ L,20 mL/L和24 mL/L三个不同的甲醇浓度,结果发现在整个诱导阶段,采用两阶段pH控制和甲醇浓度控制策略即pH 5.5,12 mL/L(过渡时期)和pH 4.5,16 mL/L (过渡时期之后的诱导阶段)可以进一步促进菌体生长和PGL生产,菌体浓度可达到162 g/L,PGL产量达到1634 U/mL,发酵结束时,细胞活力仍保持在89%,发酵液中蛋白酶浓度降至0.08 U/mL。