柑橘采后生防菌34-9抗真菌活性物质的研究

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柑橘采后因真菌性病害造成的损失严重,其中以青霉(Penicillium italicum)和绿霉(Penicillium digitatum)为主。虽然国内外已筛选出了多株柑橘采后生防菌,但能够开发应用的较少。其原因多是由于生防菌单独使用难以达到化学杀菌剂的效果,或活菌制剂的发酵工艺不够完善。这就迫切地需要对生防菌的拮抗机理进行研究,以针对性的提高其抑菌活性或改良其生物学特性。本研究旨在明确Kloeckera apiculata(34-9)产生活性抑菌物质的拮抗机理。对拮抗物质进行提取分离,检测其抑菌谱和生理生化性质;摸索其纯化条件和发酵条件;由离体、活体实验确定其抑菌作用的有效性,主要结果如下:1.确定了活性物质的提取方法。以不同饱和度的(NH42SO4沉淀不能分离出抑菌成分;采用乙醚浸提或萃取可分别从抑菌区域、无菌发酵液中分离出抑菌活性物质;经20s×4的微波处理可有效破碎酵母细胞,破碎液经乙醚萃取也可获得抑菌物质。2.对粗提取物的生理生化性质研究结果表明:粗提物对柑橘、葡萄、芒果的主要采后病害均有一定抑制作用;经121℃高温高压处理20min、胰蛋白酶、蛋白酶K处理,都不能破坏其活性;4℃下保存一个月,仍能维持较强的抑菌作用。在酵母菌对数生长中期就可检测到抑菌物质,对数生长末期达到较高值,稳定期后,其产量无显著变化。经显色反应表明,粗提取物呈酸性,其中含有酚类和黄酮类的特征基团;确定了苯:乙醚(5:5)为TLC展开的最佳条件,并在Rf值为0.78处回收获得了经纯化的活性组分;在45%的甲醇-水洗脱下,经HPLC全波长检测,证明了回收组分的纯度。3.发酵条件优化结果表明:在自然pH值条件下,接种量为1%,250ml的摇瓶中装液量为50ml,培养24h时,活性物质的产量较大。离体条件下,10倍稀释的粗提物可完全抑制柑橘青霉(P.italicum)病原孢子萌发;活体果实实验表明,粗提物水溶液可显著抑制柑橘绿霉(P.digitatum),处理4d后,防腐率达96%以上,6d后,粗提物的防腐作用显著高于发酵液。
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