论文部分内容阅读
目的：验证细胞因子FGF4、HGF启动小鼠骨髓间充质干细胞(mousebonemarrowmesenchymalstemcells，mBM-MSCs)向肝细胞分化是否通过丝裂原活化蛋白激酶(mitogenactivatedproteinkinase，MAPK)细胞信号转导通路。
方法：①采用全骨髓贴壁培养法分离6～8周小鼠骨髓来源的骨髓间充质干细胞.采用反复贴壁筛选法纯化，每3～4天更换新鲜培养液，选取形态均一、生长良好的克隆，用0.25％的胰酶-EDTA消化收集细胞继续进行传代培养。②将培养至第3～7代mBM-MSCs分为五组添加诱导培养液：A．正常对照组；B．细胞因子诱导组；C．p38抑制剂组；D．ERK1/2抑制剂组；E．MSK1抑制剂组。③在p38抑制剂组、ERK1/2抑制剂组和MSK1抑制剂组中分别添加抑制剂SB203580、U0126及H89诱导液处理7天后收集各组细胞，采用实时荧光定量PCR(Real-timeFluorescenceQuantitativePCR，Real-timeFQ-PCR)和蛋白印迹(westernblot)检测肝细胞分化早期特异性指标甲胎蛋白(α-fetoprotein，AFP)和肝细胞核因子-3β(hepatocytenuclearfactor-3β，HNF3β,alternativelycalledFOXα2)的变化，同时，westernblot检测各组中磷酸化p38(phosphorylation-p38，p-p38)、磷酸化ERK1/2(phosphorylation-ERK1/2，p-ERK1/2)和磷酸化MSK1(phosphorylation-MSK1，p-MSK1)的水平验证阻断效果。
结果：①正常对照组，mBMMSCs大部分（80％左右）贴壁伸展，呈纤维样，小部分仍为小圆形，可见放射状排列、形态均一的细胞集落；细胞因子诱导组，细胞开始收缩，并逐步向多边形转化，细胞形态与正常分离培养的小鼠肝实质细胞相似，而与正常对照组未分化的BM-MSCs有明显差异；p38抑制剂组，细胞大小缩小、聚集成团，且分化细胞形态改变的数量明显减少；ERK1/2抑制剂组，细胞缩小成块状，分化细胞形态改变的数量有所减少；MSK1抑制剂组，细胞形态差异较大，狭长且大部分呈现纤维样或小圆形，分化细胞形态改变的数量明显减少。②p38通路抑制剂SB203580和ERK1/2通路抑制剂U0126诱导液处理mBM-MSCs7天后，肝细胞早期表达基因AFP和HNF3β的表达量与细胞因子诱导组相比，均显著降低(P＜0.05)，且p38抑制剂组中其表达量降低更加明显(P＜0.01)；另外，p38通路处理组与ERK1/2处理组相比，其表达量也有显著性差异（P＜0.05）。蛋白激酶MSK1抑制剂H89诱导液处理7天后，肝细胞早期表达基因AFP和HNF3β的表达量与细胞因子诱导组相比，也显著降低(P＜0.01)。③p38通路抑制剂SB203580和ERK1/2通路抑制剂U0126诱导液处理mBM-MSCs7天后，其p-p38和p-ERK1/2的水平与细胞因子诱导组相比，均明显降低；其早期指标AFP和HNF3β的蛋白量与细胞因子诱导组相比，也显著降低。④蛋白激酶MSK1抑制剂H89诱导液处理mBM-MSCs7天后，p-MSK1水平、蛋白AFP和HNF3β的表达量与细胞因子诱导组相比，均明显减小。⑤p38通路抑制剂SB203580和ERK1/2通路抑制剂U0126诱导液处理mBM-MSCs7天后，通路p38和ERK1/2激活的蛋白激酶p-MSK1水平与细胞因子诱导组相比，表达量均明显减少。
结论：细胞因子FGF4、HGF作用BM-MSCs后，明显影响MAPK通路中ERK1/2、p38和蛋白激酶MSK1的表达量，提示细胞因子FGF4、HGF启动BM-MSCs向肝细胞分化中，MAPK是重要的信号通路。