背景:心血管疾病发病率和病死率均居各种病因前列。冠心病心肌梗死、终末期的心力衰竭目前仍欠缺理想的治疗手段。骨髓间充质干细胞（MSCs）体外诱导分化为心肌细胞是心脏病细胞治疗的重要研究方向之一，可为获得理想种子细胞被广泛应用于组织工程、细胞移植、基因治疗及器官移植，以解决心肌细胞损伤和坏死后带来的临床难题。5-氮胞苷（5-aza）是研究常用的细胞分化诱导剂，具有抑制甲基化酶活性而发挥去甲基化的作用，一般认为其诱导细胞分化的能力和其去甲基化作用有关，但针对两者间的关系和作用机理展开的研究很少。　　黄芪甲苷（AST-IV）是黄芪的提取物，是其重要的有效单体成分，研究发现黄芪及其有效组分可单独或与其他诱导剂联合诱导干细胞定向分化为心肌样细胞，也有研究报道AST-IV诱导干细胞分化为心肌样细胞的作用，但作用效果仍待进一步证实，作用机理尚不明确。本研究团队在既往的研究中发现，虽然AST-IV单独诱导MSCs定向分化为心肌样细胞的效果欠佳，但其联合5-aza共同诱导时可以使5-aza有效诱导浓度从单独诱导的10μmol/L降至联用的5μmol/L，诱导效果无显著差异，并能明显提高诱导后细胞内ANP（心房钠尿肽）mRNA表达水平及cAMP含量，联合诱导后2周，细胞β1-AR下降，认为AST-IV能在与5-aza联合诱导中起到协同促进作用，降低5-aza诱导浓度，增强细胞活性，使MSCs向心肌样细胞分化，并在分化过程中表达相关受体，从而有望成为一种新型诱导分化促进剂，但研究只观察了AST-IV与5μmol/L5-aza联用的效果，未探讨AST-IV与10μmol/L5-aza联用是否能进一步增强诱导效果，也未对其作用机理作进一步分析。　　研究认为干细胞分化与表观遗传修饰对调控相关基因的沉默及激活有重要关系，DNA甲基化是表观遗传修饰的重要方式，可能是调控干细胞分化的机理之一，而表观遗传修饰中的DNA甲基转移酶(Dnmts)的活性和 microRNA被认为是调节 DNA甲基化的重要调控和影响因素。　　目的:在以往研究的基础上，进一步观察 AST-IV在与两种剂量5-aza联用诱导 MSCs分化为心肌样细胞中所起的作用，并从表观遗传修饰的角度探讨其作用机制，为表观遗传理论在MSCs分化中的作用机理作初步探索。　　内容:本团队前期研究发现 AST-IV在与5μmol/L5-aza联用诱导 MSCs分化为心肌样细胞时,可起到协同促进作用，在诱导效果相似的前提下可将5-aza的有效诱导浓度从单独诱导的10μmol/L降为联用的5μmol/L，在此基础上，本研究增加AST-IV联合10μmol/L5-aza的观察组别，通过观察 AST-IV分别与5μmol/L及10μmol/L的5-aza联用诱导 MSCs分化为心肌样细胞的作用，并分析诱导过程中细胞相关基因启动子区域的甲基化情况、DNA甲基转移酶总活性和microRNA1的表达，初步从表观遗传修饰角度推测MSCs分化的机理，探讨AST-IV在联合诱导中的作用及可能机制。　　方法:　　1、采用密度梯度离心法分离、培养和纯化骨髓间充质干细胞，用流式细胞仪检测相关表面标志抗原对细胞进行鉴定；将鉴定过的细胞分为DMSO对照组、AST-IV组(溶解于相同浓度的DMSO)、5μmol/L5-aza组、10μmol/L5-aza、AST-IV+10μmol/L5-aza组和AST-IV+10μmol/L5-aza组等6组，进行干预诱导24小时后换正常培养液，培养2周和4周后进行相关指标的检测。　　2、观察细胞诱导过程中的形态和功能变化，用免疫组化、免疫荧光和 western blotting方法检测心肌肌钙蛋白T（cTnT）的表达，以判断诱导分化效果。　　3、MSP法（甲基化特异性PCR法）检测MSCs经诱导干预后相关基因启动子区甲基化情况。　　4、连续循环比色法定量检测MSCs诱导干预后DNA甲基转移酶总活性。　　5、荧光定量PCR检测MSCs诱导分化后microRNA1的表达。　　结果:　　1、经流式细胞仪检测鉴定，认为本研究获得的细胞为纯度较高的处于未分化状态的MSCs。　　2、MSCs的诱导分化　　（1）细胞诱导过程中形态发生了变化，但未观察到细胞有自主博动和自主收缩；　　（2）本研究免疫组化检测结果显示所有组别在干预后第2周和第4周时均有部分细胞呈 cTnT阳性表达，以 AST-IV+5μmol/L5-aza组阳性表达较为明显。结果提示包括 DMSO组在内的所有组别均能诱导部分 MSCs分化为心肌样细胞，AST-IV+5μmol/L5-aza组效果较佳；　　（3）免疫荧光检测结果发现，在干预后第2周和第4周，各组细胞均有部分细胞呈cTnT阳性表达，根据每个视野阳性细胞的比率分析，发现2周时10μmol/L5-aza组和 AST-IV+5μmol/L5-aza组诱导分化效果较好，4周时，AST-IV+5μmol/L5-aza组和AST-IV+10μmol/L5-aza组分化效果较好，10μmol/L5-aza组次之，以上结果提示包括 DMSO组在内的各组都有一定的诱导分化作用，AST-IV与5μmol/L5-aza联合应用即可达到较佳诱导效果，但与10μmol/L5-aza联用时效果未见进一步加强，10μmol/L5-aza组的诱导分化结果优于5μmol/L的5-aza组；　　（4）Western blotting检测结果发现，药物干预2周后，发现各组 cTnT蛋白都能明显表达。10μmol/L5-aza组、AST-IV+5μmol/L5-aza组、AST-IV+10μmol/L5-aza组 cTnT蛋白的表达更明显，但灰度分析值统计显示各组无显著性差异；药物干预4周后，cTnT蛋白的表达以AST-IV+10μmol/L5-aza组最为明显，其次是AST-IV+5μmol/L5-aza组，AST-IV组以及5μmol/L5-aza组表达则较其他组低，经灰度分析值统计显示 DMSO对照组、10μmol/L5-aza组、AST-IV+5μmol/L5-aza组、AST-IV+10μmol/L5-aza组蛋白表达无显著性差异， AST-IV组以及5μmol/L5-aza组与上述四组比较，蛋白表达较低，差异有极显著意义。以上结果进一步证实了免疫荧光检测的结果，即包括 DMSO组在内的各组都有一定的诱导分化作用， AST-IV与5μmol/L5-aza联合应用可达到较佳诱导效果，但与10μmol/L5-aza联用时效果未见进一步加强，10μmol/L5-aza组的诱导分化结果优于5μmol/L的5-aza组。　　3、MSP法检测相关基因启动子区 DNA甲基化情况结果发现，药物干预后第2周，10μmol/L5-aza组细胞 Tnnt2基因启动子区发生明显的去甲基化， AST-IV+10μmol/L5-aza组细胞 Tnnt2基因启动子区发生轻度的去甲基化，其他各组细胞Tnnt2基因启动子区未发生去甲基化；而在第4周，各组细胞Tnnt2基因启动子区去甲基化情况如下，DMSO对照组、5μmol/L5-aza组和AST-IV+10μmol/L5-aza组发生轻度的去甲基化，10μmol/L5-aza组去甲基化最明显， AST-IV组和 AST-IV+5μmol/L5-aza组未发生去甲基化。结果提示对于细胞 Tnnt2基因启动子区，DMSO有轻度的去甲基化作用，呈时间依赖性，5-aza有去甲基化作用，以10μmol/L为明显，5μmol/L5-aza的去甲基化作用呈时间依赖性；AST-IV可能有拮抗去甲基化试剂的去甲基化作用，甚至可能有促甲基化的作用。但对于本身处于去甲基化状态的两个基因Nkx2.5和bmp2， AST-IV组细胞在作用后第2周和第4周，基因启动子区的去甲基化状态未发生变化。该结果未能证实AST-IV具有促甲基化作用。AST-IV拮抗去甲基化试剂的去甲基化作用结果与此前推测的AST-IV可能通过加强5-aza的DNA去甲基化作用而协同促进MSCs向心肌样细胞分化的假设相反。　　4、Dnmts总活性的检测结果显示：诱导干预后2周，与DMSO对照组比较，AST-IV组出现抑制细胞 Dnmts总活性的趋势，但无显著性差异，5μmol/L5-aza组有明显抑制 Dnmts总活性的作用，差异有显著性意义，10μmol/L5-aza组、AST-IV+5μmol/L5-aza组、AST-IV+10μmol/L5-aza组表现出更明显的抑制细胞Dnmts总活性的作用，差异有极显著性意义,5μmol/L5-aza组与AST-IV组比较无显著性差异，10μmol/L5-aza组、AST-IV+5μmol/L5-aza组、AST-IV+10μmol/L5-aza组与 AST-IV组比较有显著性意差异，5μmol/L5-aza组、10μmol/L5-aza组、AST-IV+5μmol/L5-aza组、AST-IV+10μmol/L5-aza组之间比较无显著性差异；干预后4周，与 DMSO对照组比较，包括 AST-IV组在内的各组都表现出明显的抑制细胞 Dnmts总活性的作用，差异有极显著意义,与以AST-IV组比较，AST-IV+10μmol/L5-aza组Dnmts总活性降低，差异有极显著意义，5μmol/L5-aza组、10μmol/L5-aza组、AST-IV+5μmol/L5-aza组差异无显著性意义,与5μmol/L5-aza组比较，10μmol/L5-aza组和 AST-IV+5μmol/L5-aza组差异无显著性意义，AST-IV+10μmol/L5-aza组 Dnmts总活性降低，差异有显著意义,10μmol/L5-aza组、AST-IV+5μmol/L5-aza组、AST-IV+10μmol/L5-aza组间 Dnmts总活性比较，差异无显著性意义。结果提示，AST-IV有抑制Dnmts活性的作用，呈时间依赖性，与5-aza联用有加强其抑制Dnmts总活性作用的趋势，可能是其协同促进 MSCs心肌分化的原因之一，但该结果与基因启动子区 DNA甲基化情况检测结果不符，可能与 DNA甲基化和去甲基化多途径调控机制有关，也提示AST-IV在调控某些基因的DNA甲基化时可能存在双向调节机制，但需进一步研究证实。　　5、荧光定量PCR检测结果显示，在诱导干预后第2周时，AST-IV+10μmol/L5-aza组 microRNA1的表达上调，但因组间方差分析无显著性差异，结果无统计学意义，第4周各组 microRNA1的表达无显著性差异。结果未能证实microRNA1在MSCs诱导分化为心肌细胞过程中发挥了作用。　　结论：　　1、AST-IV与5-aza联合诱导MSCs分化为心肌样细胞，可以将5-aza有效诱导浓度从单独诱导的10μmol/L降低至联用的5μmol/L，但分别与10μmol/L及5μmol/L5-aza联用的诱导效果没有显著性差异；　　2、AST-IV有拮抗DMSO及5-aza对Tnnt2基因启动子区去甲基化的作用，同时能抑制 DNA甲基转移酶的总活性，后一作用呈时间依赖性，两种作用在联合诱导MSCs分化为心肌样细胞过程中的表观遗传机制仍需深入探讨；　　3、DMSO有诱导MSCs分化为心肌样细胞的作用，该组MSCs的Tnnt2基因启动子区在诱导后第4周出现轻度的去甲基化作用，研究未发现DMSO有抑制DNA甲基转移酶总活性的作用，该结果提示MSCs的诱导分化存在DNA去甲基化外的调控机制；　　4、药物对相关基因启动子去甲基化的作用与其抑制 DNA甲基转移酶总活性作用未呈一一对应关系，提示DNA甲基化和去甲基化受多途径调控，Dnmts酶活性和DNA去甲基化在MSCs心肌分化的调控作用机理复杂，有待进一步研究阐明。