黄连及其主要生物碱成分对治疗糖尿病有明显的疗效。研究发现,与正常大鼠相比较,黄连生物碱在糖尿病模型大鼠体内的生物利用度显著提高,而其作用机制尚未完全明了。由于药物的血药浓度与吸收、分布、代谢、排泄（ADME）四个过程密切相关,而ADME各环节往往需要体内广泛分布的转运体以及代谢酶的参与,因此转运体和代谢酶的功能是影响药物的生物利用度的重要因素。近期研究发现,病理状态可能会使转运体功能发生明显的改变,这种改变会使药物体内药动学受到显著的影响,严重时会导致疗效增强或产生药物毒副作用。由于黄连生物碱在体内主要是以阳离子形式存在的,其在体内的排泄过程与脏、肠道、胆管等排泄器官上广泛分布于部位转运体密切相关,由此我们推测,糖尿病病理状态可能造成了参与药物排泄的转运体功能的改变,使其排泄受到影响,导致黄连生物碱排泄量减少,进而使其血浆生物利用度显著增加。鉴于此,本课题采用糖尿病大鼠模型,以黄连碱作为黄连生物碱的模型药物,首先采用HPLC-MS/MS对黄连碱体内代谢产物进行鉴定,然后采用LC-MS/MS定量检测灌胃给药后收集的不同时间段的生物样品尿液、粪便、胆汁中原型及代谢物,探讨黄连碱在大鼠体内的排泄特性;在此基础上,采取股静脉单独给药或合用药和转运体抑制剂,比较黄连碱血药浓度的差异,确认介导黄连碱体内转运的主要转运体,以及这些转运体在糖尿病状态下的改变。完善黄连生物碱体内药动学特性,为其临床合理用药提供理论和实验依据。为此,本课题在已有研究基础上结合药动学研究的新技术和新方法,开展了以下几方面探索研究。1黄连碱在大鼠体内生物样品中原型及代谢物的鉴定制备STZ糖尿病大鼠模型,对正常及糖尿病模型大鼠称重后按20mg/kg低剂量、40mg/kg高剂量单次灌胃黄连碱,分别收集给药后0-48h的尿液和粪便以及0-36h的胆汁生物样品,在正离子模式下对处理后的生物样品进行高分辨LC-MS/MS质谱分析,对生物样品中的原型及代谢物进行鉴定。定性研究表明,黄连碱在尿液、粪便、胆汁共发现14个代谢产物,通过LC-MS/MS方法进一步分析,鉴定出尿液10个、粪便11个、胆汁中8个代谢产物。其可能发生的代谢途径主要有羟基化、去甲基化、脱氢（I相代谢）和葡萄糖醛酸结合、硫酸酯化（Ⅱ相代谢）。探讨并推测得出黄连碱在正常及糖尿病大鼠中的主要代谢途径以及可能的代谢转化方式。2 LC-MS/MS定量分析方法的建立制备糖尿病大鼠模型,建立了灵敏、准确、可靠的尿液、粪便、胆汁等体内生物样品的LC-MS/MS定量分析方法。以小檗碱为内标,采用乙腈沉淀蛋白、超声提取、高速离心方法处理生物样品,以乙腈-0.1%甲酸水为流动相,用Agilent SB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm,5μm）分离,采用多反应监测（MRM）检测模式,于正离子模式对收集的体内生物样品尿液、粪便、胆汁中黄连碱及其代谢物建立定量或半定量检测,经方法学考察,专属性、精密度、检测限、准确度和稳定性等均符合生物样品分析要求。3黄连碱及其代谢物经大鼠尿液、粪便、胆汁排泄特性研究制备糖尿病模型大鼠,根据给灌胃药剂量分为低剂量（20 mg/kg）和高剂量（40 mg/kg）通过LC-MS/MS方法进一步分析,对生物样品中的原型进行定量以及尿液10个、粪便11个、胆汁中8个代谢产进行半定量分析。探讨了黄连碱在正常及糖尿病模型大鼠不同时间段在尿液、粪便、胆汁中原型及代谢物的排泄量以及累计排泄率。正常大鼠低剂量组黄连碱总的排泄率为14.29%,其中原型排泄量占到10.61%,代谢物的排泄量占到3.68%。并且原型药物粪便排泄占到9.67%,尿液的排泄占到0.94%,胆汁排泄量较少,占到0.85×104%;正常大鼠高剂量组黄连碱总的排泄率为19.36%,其中原型排泄量占到11.8%,代谢物的排泄量占到7.56%,并且原型药物粪便排泄占到9.15%,尿液的排泄占到2.65%,胆汁排泄量较少,占到0.76×10-4%。糖尿病大鼠低剂量组黄连碱总的排泄率为11.78%,其中原型排泄量占到9.11%,代谢物的排泄量占到2.67%,并且原型药物粪便排泄占到8.69%,尿液的排泄占到0.42%,胆汁排泄量较少,占到2.4×10-4%。糖尿病大鼠高剂量组黄连碱总的排泄率为12.28%,其中原型排泄量占到8.43%,代谢物的排泄量占到3.85%,并且原型药物粪便排泄占到7.68%,尿液的排泄占到0.75%,胆汁排泄量较少,为0.68×10-4%。由此推断黄连碱的主要排泄途径是以原型的形式通过粪便排泄,该结论为黄连碱的体内药动学及临床给药研究提供了参考。同时,与正常大鼠比较,黄连碱在糖尿病大鼠体内的排泄率有明显的降低,表明排泄是影响黄连碱生物利用度升高的一个重要因素。4影响黄连碱排泄机制初探根据给药方式将正常以及糖尿病模型大鼠均分为黄连碱组（COP）、黄连碱合用OCT抑制剂西咪替丁组（COP-C）、黄连碱合用P-gp抑制剂维拉帕米（COP-V）组,且每组均根据黄连碱的给药量分别设置低（10 mg/kg）、高剂量（20mg/kg）组。每组对应单次股静脉给药,于给药后5、10、15、30、45 min、1、1.5、2、3、4、6、8、12 h时间点将大鼠乙醚麻醉进行眼眶取血,LC-MS/MS检测不同时间点血浆中黄连碱的血药浓度,比较在有无转运体抑制剂时黄连碱血浆药动学的差异。由药时曲线图中,与无OCT、P-gP抑制剂组相比,黄连碱的血药浓度在有OCT抑制剂西咪替丁存在时血药浓度有所升高,在有P-gp抑制剂维拉帕米存在时血药浓度相应降低,统计学得出,药时曲线下面价AUC具有显著性差异P＜0.05,推测可能与黄连碱是OCT、P-gp的作用底物有关,在OCT抑制剂存在时其细胞摄取能力降低,从而血药浓度增加,也可能是糖尿病状态下,OCT转运体的功能可能发生了变化,其结果是转运体的功能受到抑制,摄取功能降低,也可能是因为糖尿病状态下,P-gp转运体的功能发生了变化,其结果是转运体的功能受到抑制。模型M-COP-G组与正常COP-G组相比较,MRT有显著性差异P＜0.05,而当有抑制剂存在时M-COP-V-G与COP-V-G组没有这种显著性,可能OCT、P-gp转运体对黄连碱的在时间速率上影响了黄连碱的体内处置。与正常COP-D组相比较,M-COP-C-D组Cmax没有显著性差异,而与正常COP-G组相比较,M-COP-C-G组Cmax显著降低P＜0.05,与正常COP-D组相比较,M-COP-V-D组Cmax显著降低P＜0.05,与正常COP-G组相比较,M-COP-V-G组Cmax显著降低P＜0.05,推测OCT抑制剂西咪替丁可能与底物浓度有关。通过以上研究,首次利用LC-MS/MS对不同时间段各排泄物样品中的黄连碱原型及其代谢物的排泄率进行研究,探讨了黄连碱在正常和糖尿病大鼠体内的主要排泄形式及途径,得出黄连碱主要是以原型通过粪便实现消除过程,完善了黄连碱的排泄动力学特性,并且与正常大鼠相比较,糖尿病模型大鼠中,黄连碱及其代谢物的排泄率都相对较低,这也为黄连碱在糖尿病大鼠中生物利用度较高提供理论依据。基于黄连碱在糖尿病模型中排泄发生变化这一现象,进一步通过转运体抑制剂存在下黄连碱血浆药动学的研究,初步探讨影响黄连碱排泄的机制明确了转运体OCT、P-gp参与介导了黄连碱的转运,但是否为黄连碱排泄的主要影响因素,尚待进一步研究确认,因为本次实验所采用的抑制剂只有一个,每个抑制剂的作用机制不同,抑制的效果是不一样的,完善的实验设计是多选择几个抑制剂来试验。总之,排泄是影响药物生物利用度重要因素,对黄连碱排泄的研究能使黄连碱的排泄动力学得到完善,也为其在治疗糖尿病方面提供了一定的理论依据。