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研究内容:本研究分为三个部分:1、广西乙型肝炎病毒(HBV)相关原发性肝细胞癌复发患者原发瘤及复发瘤癌组织中CK19相对表达量与临床病理特征及临床预后关联分析;2、利用小RNA干扰技术,沉默CK19基因后,分析CK19对肝癌细胞株MHCC-97H、Hep-3B的生物学行为的影响。3、利用高通量测序技术从全转录水平分析CK19基因影响肝癌细胞株Hep-3B 生物学行为的差异 RNA 表达(mRNA/miRAN/lncRNA/cirRNA),并构建竞争性内源RNA(ceRNA)网络调控,从转录组组学层面探究CK19阳性表达HCC具有更高恶性生物学行为潜在分子机制。第一部分 CK19阳性表达与广西HBV相关原发性肝细胞癌术后复发瘤临床病理特征及临床预后关联分析目的:对比分析广西HBV相关原发性肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)原发瘤与复发瘤之间细胞角蛋白19(cytokeratin 19,CK19/KRT19)相对表达差异及临床病理特征与临床预后的关系。材料与方法:收集2002年1月至2017年12月在广西医科大学第一附属医院肝胆外科行肝脏肿瘤切除术的复发性HBV相关原发性肝细胞癌病例24例,对其HCC原发瘤及复发瘤癌组织进行CK19免疫组化染色,并分析24例HCC患者原发瘤及复发瘤的临床病理因素与CK19蛋白表达的关系及CK19阳性表达对HCC患者预后的影响。结果:24例HCC患者无论原发瘤或是复发瘤,CK19只在癌组织中表达,癌旁组织均未检测到CK19的表达。HCC复发瘤组织中CK19蛋白阳性表达细胞比例高于原发瘤(X2=8.545,P=0.003),差异有统计学显著性,且复发瘤的分化程度与原发瘤的分化程度的差异有统计学显著性(X2=4.128,P=0.047);HCC原发瘤CK19表达阳性的HCC病例其无瘤存活时间较短(P=0.05)。结论:在广西HBV相关HCCCK19阳性表达特殊亚型中,术后肿瘤再次复发时,原发瘤中CK19阳性表达细胞比例更高,原发瘤CK19表达阳性的HCC病例其无瘤存活时间较短,这提示CK19阳性表达可能是肿瘤复发的高危因素。第二部分 CK19对肝癌细胞株MHCC-97H、Hep-3B细胞生物学行为的影响目的:探讨siRNA沉默CK19基因后对肝癌细胞株MHCC-97H、Hep-3B细胞增殖、迁移、侵袭、细胞周期和凋亡的影响。方法:将siRNA-CK19片段转染至人肝癌细胞株MHCC-97H、Hep-3B中沉默CK19基因,然后利用Real-time PCR、Western Blot、细胞免疫组化、流式细胞仪、CCK8、划痕实验、Transwell小室实验检测沉默CK19后对肝癌细胞株增殖、迁移、侵袭、细胞周期与凋亡的影响。结果:转染后的肝癌细胞株MHCC-97H、Hep-3B经Real-time PCR和Western Blot技术检测后,我们发现针对CK19基因的si-RNA3沉默效果最好。在si-RNA3转染后的肝癌细胞株MHCC-97H、Hep-3B中,沉默CK19基因后,肝癌细胞CK19基因及蛋白表达降低,在肝癌细胞株MHCC-97H中,其垂直、水平迁移及侵袭能力减弱,肝癌细胞株MHCC-97H、Hep-3B中G2期的细胞含量百分比有增加趋势,且细胞凋亡百分率显著升高。结论:siRNA靶向沉默肝癌细胞株MHCC-97H和Hep-3B中CK19基因后,能显著降低细胞株CK19基因和蛋白的表达,使得G2期的细胞含量及细胞凋亡百分比增加,提示沉默CK19基因后HCC细胞的迁移及侵袭能力显著减弱,并可诱导肝癌细胞株MHCC-97H、Hep-3B的细胞周期停滞在G2-M期从而抑制HCC增殖。第三部分 基于转录组测序的CK19 阳性肝癌细胞株Hep-3B竞争性内源RNA调控网络的构建目的:利用高通量测序技术从全转录水平分析CK19基因影响肝癌细胞株Hep-3B 生物学行为的差异 RNA 表达(mRNA/miRNA/lncRNA/circRNA),并构建竞争性内源RNA(ceRNA)网络调控,从转录组学层面探究CK19阳性表达HCC具有更高恶性生物学行为的潜在分子机制。方法:本研究通过在转染siRNA的方法沉默肝癌细胞株Hep-3B细胞CK19基因表达,采用Illumina HiSeq2500平台进行全转录组测序。并利用edgeR、R包clusterProfiler等软件进行相关生物信息学功能注释与富集分析。结果:每个样品完成与参考基因组序列比对,以及lncRNA,circRNA,miRNA以及基因预测。共识别到20066个lncRNA,其中14704个新的lncRNA;3 704 个 miRNA,其中有 1 806 个已知 miRNA,1898 个新的 miRNA;25846个gene,其中有6199个新的gene;并预测得到1668个新的circRNA。对每种RNA进行表达定量并进行差异筛选分析,筛选出1099个lncRNA(601个上调,498个下调),10个circRNA(4个上调,6个下调),281个miRNA(178个上调,103个下调)和779个mRNA(393个上调,386个下调),并对差异表达的mRNA、circRNA的来源基因、lncRNA的靶基因、miRNA的靶基因进行功能注释和富集分析后构建了基于ceRNA网络的差异 lncRNA-miRNA-mRNA 和 circRNA-miRNA-mRNA 调控关系对。结论:我们通过CK19沉默的肝癌细胞株进行转录组测序分析,发现了潜在的CK19调控肝癌细胞株增殖、细胞周期、凋亡相关的差异表达基因,并构建了相应的ceRNA调控网络,为阐明CK19影响HBV相关原发性肝细胞癌术后复发的相关分子机制提供了方向及策略。