2010年春夏之交,我国江浙和山东等地区均报道了以一种引起鸭产蛋率大幅下降、生长发育迟缓、卵巢出血为主要症状的急性传染病,之后广泛传播到我国的大部分地区,并给蛋鸭的养殖业造成了很大的经济损失。感染鸭群主要表现为采食量和产蛋量的急速下降,依照发病的日龄不同,死亡率为5%~10%之间。经过国内多个试验室的诊断和病毒的分离,可以确定该病是由黄病毒引起的,隶属黄病毒属(Flavivirus)、恩塔亚病毒群(Ntaya virus group)的鸭坦布苏病毒(duck Tembusu virus,DTMUV)。研究坦布苏病毒蛋白的结构功能及建立快速检测方法,是控制该病的有效措施。本研究建立了快速检测坦布苏病毒的胶体金检测方法,成功地制备了抗坦布苏病毒NS5蛋白的单克隆抗体,为防治该病提供了技术支持。本研究内容分为以下两个部分:1.坦布苏病毒NS5蛋白单克隆抗体的制备本研究利用本试验室构建的PET-28a+NS5原核表达载体,成功转化入大肠杆菌BL21细胞,并纯化产生的坦布苏病毒NS5蛋白。利用纯化的NS5蛋白免疫6-8周龄的BALB/c小鼠,经过细胞融合、间接ELISA筛选和有限稀释亚克隆法获得了3株稳定分泌针对坦布苏病毒NS5蛋白的单克隆抗体A4D1、B4B8和C12D2,并对A4D1和B4B8进行相关特性鉴定。经ELISA效价测定,两株单抗的细胞上清效价均为1:100,诱导产生腹水的效价分别为1:128000和1:64000。间接ELISA结果表明,两株单抗只与DTMUV反应,无交叉反应性。Western blot和IFA结果表明,两株单抗均可与体外纯化的NS5蛋白以及坦布苏病毒发生特异性反应。抗坦布苏病毒NS5蛋白单克隆抗体的成功研制,为坦布苏病毒的免疫学诊断及致病机理的研究奠定基础。2.坦布苏病毒胶体金检测试纸条方法的建立利用试验室保存的抗坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体A12D3为金标抗体,制备的鼠抗E蛋白多克隆抗体为包被抗体,建立了双抗体夹心胶体金试纸条检测坦布苏病毒的方法。用该试纸条可特异性检测坦布苏病毒,在10~15 min即可观察检测结果。利用建立的胶体金试纸条的方法和RT-PCR对50份临床样品进行检测比较,结果显示两者符合率为93.8%。该试纸条重复性好,特异性高,可用于坦布苏病毒的临床快速诊断。