论文部分内容阅读
金钗石斛(Dendrobium nobile Lindl.)为兰科(Orchidaceae Juss.)石斛属(Dendrobium Sw.)附生草本多年生植物,是中国药典历版收载的中药材石斛的基源植物之一,具有益胃生津、滋阴清热之功效,是一种药用范围很广的名贵传统中药。现代的药理学研究表明了金钗石斛的生物碱对心血管、白内障、胃肠道和呼吸系统等疾病具有较好的疗效。赤水金钗石斛产量占全国70%,而生产中发现不同生态环境、不同长势、不同生长年限、不同采收期金钗石斛商品中石斛碱含量差异大,研究还发现不同生育阶段金钗石斛茎中石斛碱含量差异显著,为保证赤水金钗石斛产业的发展,金钗石斛碱含量的稳定可控,了解石斛碱在植株体内如何产生、转运、积累,如何调控栽培措施,都需要了解金钗石斛碱的代谢机制。而石斛碱在植株体内的分布与积累特性不清晰,代谢途径不清楚,导致石斛碱代谢调控研究甚少。本试验以各生育期金钗石斛为试验材料,研究金钗石斛干物质积累与分配规律、石斛碱积累与分配特性,发现石斛碱含量与金钗石斛的不同发育阶段有关,为此,以石斛碱含量存在显著差异的4个时期金钗石斛茎为样本,进行数字基因表达谱(Digital Gene Expression Profiling,DGE)的测序,同时构建金钗石斛转录组(transcriptome)文库,对4个时期金钗石斛茎差异表达基因(Differenti al Expression genes,DEGs)进行分析,比较差异表达基因的数量、功能和表达模式,系统筛选参与石斛碱代谢相关基因,并通过实时荧光定量PCR技术进行验证,初步提出了石斛碱代谢是萜类合成途径的推论。研究结果如下:(1)石斛碱含量与金钗石斛的不同发育阶段有关。一年生金钗石斛茎和叶中石斛碱含量出现2次升高的过程,分别是3-6月份、10-12月份和3-6月份、9-12月份;二年生金钗石斛茎和叶中石斛碱含量的2次升高的过程,分别是4-6月份、10-12月份和2-6月份、9-12月份;金钗石斛新芽萌发生长分别是2-6月份和9-12月份,石斛碱含量的2次升高与金钗石斛的2次新芽萌发生长在时间上吻合,表明石斛碱含量与金钗石斛幼芽萌发生长阶段有关。(2)石斛碱在金钗石斛幼嫩组织中含量高。一年生金钗石斛茎中石斛碱含量在3-6月份增长的较快,从3月份含量0.22%增长到6月份含量达0.97%,单位干物质石斛碱增长量最高在4-5月份,达10.47mg/g;二年生金钗石斛茎在4-6月份,石斛碱含量由0.33%增长到0.43%。6月份一年生茎中石斛碱含量是二年生的2倍多。(3)石斛碱具有转移的特性。二年生金钗石斛茎中石斛碱积累量呈“降低—升高—降低—升高”波动性变化,2个降低过程正是新芽形成萌发的过程,石斛碱向幼嫩组织转移;石斛碱积累量的2次升高过程,是幼嫩组织产生的石斛碱和植株叶片脱落前自身石斛碱,向贮藏器官茎的转移。4月下旬-8月下旬是一年生金钗石斛旺盛生长期,在4月下旬-6月下旬是石斛碱迅速积累期,6月下旬-8月下旬是干物质迅速积累期,单位干物质石斛碱含量降低。表明石斛碱具有向幼嫩组织(生长点)或贮藏器官转移的特性。(4)一年生金钗石斛干物质和石斛碱积累量与分配与二年生截然不同。一年生金钗石斛整枝干物质积累量呈“S”变化,可用Logistic方程拟合,8月份前叶片生长占主体,8月份后进行茎干物质积累;而二年生干物质整枝积累量总体呈递减变化,茎干物质积累量整个生育期变化不大。一年生金钗石斛进行营养生长,而二年生金钗石斛进行无性繁殖生长。一年生金钗石斛茎中石斛碱含量变化大,变化范围0.22%-0.97%,茎石斛碱积累量总体呈“快—慢—快”的增长趋势,茎石斛碱分配率始终大于叶片;1月份和12月份二年生金钗石斛石斛碱含量和积累量均差异不大,茎石斛碱分配率始终高于叶片。一年生金钗石斛干物质积累量与整枝、茎和叶中石斛碱积累量呈极显著正相关。(5)通过构建金钗石斛转录组文库,获得79,436个Unigene,平均长度是780 nt,有55,393条Unigene被注释到Nr,Nt,Swiss Port,KEGG,COG,G O六个公共数据库,占总Unigene的69.73%。有30,061个Unigene序列被注释到128条KEGG代谢途径,代谢通路分析显示,有426条基因参与萜类化合物骨架生物合成(ko00900)路径,有28条基因参与倍半萜和三萜类化合物的生物合成(ko00909)路径。(6)构建了石斛碱含量具有显著差异的4个时期数字基因表达谱文库,以金钗石斛转录组序列为参考基因组,对表达谱文库进行分析。6月和10月、9月、8月间DEG数量分别是2482、2332和1487个,均表现下调基因大于上调基因;8月与9月、10月,9月与10月间DEG数量分别是,1361,1614和1619个,均表现上调基因大于下调基因。而后对样本之间的差异基因进行了表达模式聚类分析、GO功能富集分析和代谢路径富集分析。综合4个DGE代谢路径富集分析显示17条基因参与了萜类化合物骨架生物合成路径,2条参与了倍半萜和三萜类化合物的生物合成路径。(7)筛选了5个参与石斛碱代谢途径的关键酶基因,分别是甲羟戊酸激酶基因(Unigene1219),赖氨酸甲基化酶基因(CL429),异戊烯二磷酸异构酶基因(CL3435),法尼基转移酶基因(CL11407)和半胱氨酸甲基酯酶基因(CL8067),通过实时荧光定量PCR定量表达对RNA-Seq差异表达基因的表达量进行验证,发现两种方法测定的DEG表达变化相似,决定系数R2为0.4666,相关性达到极显著水平。石斛碱生物合成途径先按照萜类化合物形成的共同途径至单萜(萜类形成的共同前体途径即甲羟戊酸(MVA)途径和2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸(MEP)途径),再按照倍半萜途径进行生物合成。本文从金钗石斛石斛碱含量、积累量及干物质积累基本的生长生理过程进行研究,发现了石斛碱含量差异变化显著的时期和部位,借助了转录组和数字基因表达谱的手段,开展石斛碱代谢研究,提出了石斛碱生物合成的途径—萜类途径,为石斛碱生物合成路径的研究指明了方向,并为其它萜类生物碱研究及金钗石斛中其它次生代谢物研究提供了平台。