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一、白血病／肿瘤血管新生相关基因的表达及调节 1 肿瘤细胞系血管内皮生长因子及其受体基因共表达的研究 目的：分析血管内皮生长因子(VEGF)及其受体(Flt-1和KDR)基因在恶性肿瘤细胞系中的共表达。方法：以看家基因为内标，采用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)分析VEGF及其受体基因在30种肿瘤细胞系和4种内皮细胞中的表达水平。结果：在29种肿瘤细胞系和3种内皮细胞系检测到中度以上的VEGF基因表达，而人脐静脉内皮细胞仅有低表达；Flt-1基因表达分别见于50％(6／12)的血液肿瘤，28％(5／18)的实体瘤细胞和2种内皮细胞；仅在16.7％(2／12)的血液肿瘤，33.3％(6／18)实体瘤细胞和2种内皮细胞分别检测到KDR基因表达；而ECV304细胞并无Flt-1或KDR基因的表达。结论：VEGF基因高表达是肿瘤细胞的重要特征，而共表达VEGF及其受体表明自分泌途径的存在。 2 全反式维甲酸对NB4细胞血管内皮生长因子基因表达的调节作用 目的：建立VEGF基因竞争性定量RT-PCR(cQRT-PCR)方法并分析全反式维甲酸(ATRA)对NB4细胞VEGF基因表达的调节作用。方法：通过基因内部缺失方法构建VEGF基因竞争模板，将系列稀释的靶分子与恒量的竞争模板共扩增，可获得标准曲线用于计算待测样本中靶基因的分子数。结果：cQRT-PCR检测VEGF基因表达的范围约为1×10~4～2×10~5分子；经ATRA处理0，12，24或48h后，随着CD11b表达上调和NBT还原率增加，NB4细胞中VEGF基因转录本的数量分别为42.3×10~5，12.6×10~5，3.6×10~5或低于1.0×10~5／μg总RNA。结论：ATRA显著抑制VEGF表达并可能通过抑制血管新生来发挥部分抗白血病功效。 二、抗血管新生重组蛋白的表达及性质研究 1 Ⅳ型胶原片段的基因克隆与表达 目的：重组表达中国人阻滞原并分析其抑制血管新生的能力。方法：利用高保真聚合酶链反应(HF-PCR)从胎肝细胞克隆Ⅳ型胶原α1链NC1结构域编码序列，即阻滞原基因；将阻滞原基因克隆入表达载体pQE-31，转化大肠杆菌M15[pREP4]并诱导蛋白表达，蛋白电泳与免疫印迹鉴定重组蛋白。结果：从胎肝细胞克隆的人阻滞原基因长687bp，编码229个氨基酸；经IPTG诱导后可出现28kDa的蛋白条带，最高可占总菌体蛋白的32％，并经免疫印迹证实；鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)分析显示重组阻滞原具有抑制血管新生的作用。结论：原核表达的重组阻滞原