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目的毛孢子菌引起的侵袭性感染被认为是恶性血液病患者真菌病的第二大病因,在免疫功能受抑制的患者中的死亡率极高,且不同物种对抗真菌药物的耐药性不同。快速、准确的毛孢子菌鉴定与检测有助于早期诊断、指导临床早期抗真菌药物治疗。方法1.毛孢子菌的分子鉴定1)收集到72株毛孢子菌后进行培养,并对内转录间隔区(ITS)进行PCR扩增后测序,经序列比对确定物种名称;2)结合从NCBI网站下载相应毛孢子菌的参考序列,使用MEGA软件构建N-J树,进行系统发育分析。2.毛孢子菌的高分辨率熔解曲线分析方法建立与初步评价1)比对毛孢子菌的ITS序列,设计引物;2)优化反应条件;3)对毛孢子菌、常见致病性真菌和人基因组DNA进行特异性、灵敏度和检测下限分析,构建标准曲线。3.毛孢子菌的多重荧光PCR方法建立与初步评价1)比对毛孢子菌的ITS及28S基因序列,设计引物与探针;2)优化反应条件;3)对毛孢子菌、常见致病性真菌和人基因组DNA进行特异性、灵敏度和检测下限分析,构建标准曲线;4)在相同模板量与反应条件下,比较单重荧光与多重荧光PCR的Ct值,对多重荧光PCR体系进行评估。结果1.DNA测序结果将72株毛孢子菌鉴定为5个种,分别为T.asahii,T.dermatis,T.inkin,T.dohaense,T.montevideense,其中T.asahii为主要的物种;经系统发育分析发现,种间关系与鉴定结果一致,不同物种之间存在明显的进化差异。2.高分辨率熔解曲线分析结果显示,5种毛孢子菌在不同的温度范围内出现熔解峰,T.montevideense的温度范围为75.41-78.05℃(Tm值为77.23±0.070℃),T.dermatis为76.16-78.52℃(Tm值为77.70±0.050℃),T.dohaense为76.55-78.63℃(Tm值为77.94±0.070℃),T.asahii为76.72-79.07℃(Tm值为78.31±0.025℃),T.inkin为77.53-80.26℃(Tm值为79.37±0.045℃),通过Tm值及熔解曲线分布可有效进行区分;以常见致病性真菌及人DNA作为阴性对照,特异性为100%;与DNA测序结果对比,准确性为100%;通过构建标准曲线发现,T.montevideense,T.dermatis,T.dohaense,T.asahii,T.inkin的检测下限均为160 copies。3.多重荧光PCR经优化,发现双重荧光与三重荧光PCR即可实现5种菌的鉴定;以常见致病性真菌及人DNA作为阴性对照,特异性为100%;与DNA测序结果对比,准确性为100%,构建的标准曲线显示,5种毛孢子菌的检测下限均为40 copies;在相同模板量与相同条件下,T.asahii和T.montevideense在不同体系下,Ct值的变化具有统计学意义(P<0.05),其他毛孢子菌的不同检测体系的Ct值变化无统计学差异(P>0.05)。结论1.系统发育分析结果与测序结果一致,rDNA ITS测序可准确将毛孢子菌鉴定至种水平。2.Real-time PCR结合HRM分析为毛孢子菌的准确、快速鉴定提供了一种操作简单、时间短、成本较低的方法,实现了闭管分析,可与培养结合,辅助临床上对侵袭性毛孢子菌病的早期诊断。3.基于ITS与28S序列的多重荧光PCR,鉴定5种毛孢子菌的准确性与特异性为100%,检测下限为40 coyies,是一种简单、准确、特异性好、灵敏度高的分析方法,可以进行定量分析,有利于临床早期诊断并指导临床早期抗真菌药物治疗。