[研究背景及目的]肿瘤转移是恶性肿瘤重要特征,也是引起肿瘤患者死亡的最主要的因素。肿瘤转移是一个多步骤、多因素参与的复杂过程,其主要步骤包括肿瘤细胞从原位肿瘤的脱离、穿过基底膜进入血管、在血液中的存活以及穿过血管基底膜进入远处的组织器官定植形成转移灶。越来越多的研究显示,除了肿瘤细胞自身的生物学特性的改变外,“宿主”(机体)因素如肿瘤微环境、机体的免疫细胞及血小板等在肿瘤转移中起重要的作用。Toll样受体4(TLR4)为Toll样受体超家族成员之一,是一类进化上十分保守的跨膜受体,主要表达于骨髓来源的细胞,另外在上皮细胞和多种肿瘤细胞上也有表达。TLR4与配体如内毒素(LPS,外源性)、HMGB1(内源性)等的结合可活化下游多条信号通路,从而引起相关细胞活化,在机体天然免疫反应、组织损伤修复以及肿瘤发生发展等过程中发挥重要的作用。大量研究表明肿瘤细胞上的TLR4对肿瘤进展有明显的促进作用,但机体细胞表达的TLR4在肿瘤转移中的作用现在尚不清楚。肿瘤转移是一个非常低效的过程,进入血液的肿瘤细胞绝大部分会被机体的免疫细胞清除,因此肿瘤细胞在血液中的存活对肿瘤转移至关重要。血小板通过多种机制在这一过程中起了关键的作用：血小板通过与肿瘤细胞的相互作用可防止肿瘤细胞被清除；肿瘤细胞引起血小板活化后分泌的细胞因子可促进肿瘤细胞上皮间质转换从而增加肿瘤细胞的转移潜能。血小板来源于骨髓中的巨核细胞,其细胞膜表面表达所有LPS受体信号元件成分(包括TLR4、CD14、MD2、MYD88)。在急性细菌感染如脓毒血症中,表达于血小板的TLR4起到了联系血小板和其他免疫细胞的“桥梁”作用,抑制了病原体在体内蔓延。考虑到肿瘤细胞可产生大量的TLR4内源性配体HMGB1,血小板上的TLR4可能在介导血小板--肿瘤相互作用过程中起了重要作用。本项目拟应用小鼠肺转移模型探讨TLR4在肿瘤转移中的作用,同时利用骨髓移植、抗血小板药物及中和性抗体等方法研究血小板的TLR4对肿瘤转移的影响,最后利用血小板——肿瘤细胞共培养模型采用分子生物学和细胞学的方法探讨TLR4影响肿瘤转移的机制,为恶性肿瘤转移的防治提供有潜在临床价值的实验数据。[实验方法]1.建立野生型小鼠及TLR4敲除(TLR4-/-)小鼠肿瘤肺转移模型,比较此两种小鼠中引起肺转移负荷的差异；利用荧光标记的肿瘤细胞检测TLR4对肿瘤血行转移早期的影响；2.建立小鼠肺转移模型,比较TLR4激活剂LPS与TLR4拮抗剂TAK-242对肿瘤转移的影响；3.利用骨髓移植实验研究表达在实质细胞和非实质细胞上的TLR4在肺转移模型中的作用；4.建立野生型小鼠肺转移模型,利用抗血小板的药物,比较抗血小板处理组和未处理组引起的肺转移负荷；5.利用血小板—肿瘤细胞共培养实验,通过荧光显微镜检测血小板与肿瘤细胞的粘附,利用ELISA法及流式细胞术检测肿瘤细胞引起的血小板的活化情况,研究TLR4对血小板—肿瘤细胞相互作用的影响；6.利用Transwell与Matrigel实验检测血小板对肿瘤细胞迁移与浸润的影响。7.应用ELISA法检测及Western Blot法检测肿瘤细胞的上清中及荷瘤小鼠中HMGB1的表达；8.应用HMGB1中和抗体在体内及体外研究对肿瘤转移的影响。[实验结果]1.机体TLR4缺失可明显抑制肿瘤的肺转移；2.机体TLR4活化可明显促进肿瘤肺转移,而TLR4拮抗剂可明显抑制肿瘤肺转移；3.骨髓来源细胞上的TLR4促进肿瘤转移；4.抗血小板药物可明显抑制在野生型小鼠的肿瘤肺转移,对TLR4-/-小鼠中无明显作用；5.血小板TLR4缺失可明显抑制血小板--肿瘤细胞相互作用；6.TLR4缺失的血小板对肿瘤细胞迁移和浸润的促进作用减弱；7.肿瘤细胞上清及荷瘤小鼠血浆中的HMGB1的水平升高；8.HMGB1中和抗体可通过TLR4依赖的方式影响血小板—肿瘤细胞相互作用及肿瘤转移。[实验结论]本研究从细胞和动物学水平证明血小板上的TLR4在肿瘤转移中起重要作用,并发现肿瘤细胞来源的HMGB1是介导血小板TLR4活化的重要因素。肿瘤细胞释放HMGB1可作用于血小板上的TLR4引起血小板活化,一方面促进了血小板—肿瘤细胞粘附,从而保护了血液中的肿瘤细胞不被清除,促进了肿瘤细胞在肺内的滞留；另一方面,活化的血小板可分泌TGFβ1,促进了肿瘤细胞的迁移和浸润。通过抑制HMGB1的释放从而抑制血小板TLR4的活化可有效抑制肿瘤转移。