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研究目的:
抗磷脂综合征(antiphos pholipid syndrome,APS)病理机制及临床症状与血栓形成密切相关,但有关其血栓形成的机制仍未阐明。研究表明,膜联蛋白Ⅱ(AnnexinA2,ANX2)作为抗磷脂抗体/抗原复合物(anti-β2-glycoproteinⅠ/β2-glycoproteinI,anti-β2GPI/β2GPI)的受体,在介导自身抗体激活细胞过程中发挥重要作用。然而,ANX2缺乏膜内结构,不能传递胞外信号至胞内。本课题组前期研究揭示,在anti-β2GPI/β2GPI复合物刺激人单核细胞株THP-1表达组织因子(tissue factor,TF)的过程中,跨膜蛋白Toll样受体4(Toll-like receptor4,TLR4)能够被诱导表达并参与细胞的激活作用。本论文将深入阐明TLR4、ANX2及β2GPI三者之间的关系,进一步探讨TLR4的二个不同接头分子,MyD88(myeloid differentiationfactor88)及TRIF(TIR-domain-containingadaptorinducinginterferon-β)是否同样参与了anti-β2GPI/β2GPI对THP-1细胞的激活,旨在全面阐明TLR4及其信号通路在APS病理机制中的作用。
研究方法:
(1)免疫共沉淀及Westernblotting检测anti-β2GPI/β2GPI复合物与THP-1细胞表面受体TLR4、ANX2的结合情况,证明细胞表面是否有β2GPI、ANX2和TLR4三者的复合物。
(2)利用实时定量PCR(Real-timequantitativePCR,RT-qPCR)检测anti-β2GPI/β2GPI诱导THP-1细胞TF和TNF-αmRNA的表达,采用试剂盒检测细胞TF活性和TNF-α分泌水平。
(3)RT-qPCR、Westernblotting检测anti-β2GPI/β2GPI对MyD88和TFIF表达的影响。
(4)观察TLR4特异性抑制剂-Tak-242是否干预anti-β2GPI/β2GPI
诱导THP-1细胞MyD88、TRIF、TF及TNF-α的表达。
研究结果:
(1)免疫共沉淀及Westernblotting分析,发现THP-1细胞表面存在β2GPI、ANX2和TLR4三者的复合物。
(2)Anti-β2GPI/132GPI(100μg/mL)能够刺激THP-1细胞表达TF(mRNA及活性)和TNF-α(mRNA及蛋白),与对照相比差异显著(p＜0.05)。
(3)Anti-β2GPI/β2GPI(100μg/mL)刺激THP-1细胞后,MyD88和TRIF的mRNA及蛋白水平均增高,并显示时间相关性。
(4)TLR4抑制剂TAK-242(5μmol/L)明显抑制anti-β2GPI/β2GPI对THP-1细胞MyD88和TRIFmRNA及蛋白表达的刺激效应,同时降低细胞TF和TNF-α的表达。
结论:
(1)在THP-1细胞,TLR4与ANX2作为βGPI的共受体,能够介导anti-β2GPI/β2GPI复合物刺激细胞表达TF、TNF-α,从而参与APS高凝及血栓形成。
(2)在anti-β2GPI/β2GPI激活THP-1细胞的过程中,TLR4的二个不同接头分子,即MyD88和TFIF均被诱导表达增加,提示MyD88及TFIF依赖的信号途径均参与了细胞激活。
(3)TLR4抑制剂TAK-242可以干预上述过程,抑制信号分子MyD88、TFIF及效应分子TF、TNF-α的诱导表达,为APS血栓形成的预防及治疗提出了新思路。