细胞板上囊泡的拴系和融合对植物胞质分离是至关重要的。Exocyst属于多亚基复合物的一类拴系因子，它含有八个亚基。Exocyst主要作用于SNARE复合体介导囊泡与质膜融合之前的拴系过程。在拟南芥中，SEC6是Exocyst复合体中由单基因编码的一个亚基，已有研究报道SEC6主要影响雄配子的发育。另外，SEC6定位在拟南芥的细胞板上，但是对于SEC6是否影响植物的胞质分离还不清楚。为了进一步研究SEC6在拟南芥中的功能，我们以SEC6为诱饵筛选拟南芥cDNA文库，获得了SEC6的互作蛋白KEULE。KEULE属于植物SEC1家族蛋白，已有研究报道keule突变体具有胞质分离异常的表型。我们通过多种实验方法进一步证实了SEC6和KEULE互作的真实性，并且对它们在胞质分离过程中的功能进行了研究。　　1.SEC6互作蛋白KEULE的筛选以及互作区段的解析　　将拟南芥基因SEC6融合到载体pGBKT7中，通过酵母双杂交的方法筛选拟南芥cDNA文库，获得了与其互作的蛋白KEULE。β-半乳糖苷酶活性检测进一步显示SEC6和KEULE具有很强的互作。我们把KEULE蛋白分成不同的区段，来解析其与SEC6互作的特异性区域。通过酵母双杂交方法发现KEULE蛋白的C1段（456-596aa）是与SEC6互作所必需的最小区域。　　2.SEC6和KEULE互作的体内体外验证　　除了酵母双杂交外，我们还通过多种方法进一步证实了SEC6和KEULE之间的相互作用。首先，我们在大肠杆菌中表达并纯化了GST-SEC6、HIS-KEULE、HIS-KEULE-C和HIS-KEULE-C1融合蛋白，体外GSTPull-down实验结果表明SEC6和KEULE之间的直接作用，且KEULE蛋白的C1段对于KEULE和SEC6的互作是必需的;其次，免疫共沉淀(CO-IP)实验也表明SEC6和KEULE在细胞内的相互作用;最后，BiFC实验结果表明:2YN-SEC6或2YC-KEULE在洋葱或烟草表皮细胞中单一表达时没有荧光产生，只有2YN-SEC6和2YC-KEULE共同表达时才会产生黄色荧光，而且这种荧光在细胞膜和胞质内呈点状分布，通过对这些点状结构的分析发现它们能和Exocyst复合体亚基Exo70E2共定位。结合之前的酵母双杂交结果，我们证明SEC6和KEULE之间存在相互作用。　　3.SEC6和KEULE蛋白的功能研究　　为了研究SEC6和KEULE在植物生长发育中的作用，我们订购了两个sec6突变体株系（Salk_078235:sec6-1/+，Salk_072337:sec6-2/+）。遗传分析说明sec6突变体为雄配子致死，从而不能产生纯合后代，sec6花粉体外萌发时花粉管呈现短小肿大的表型。为了更好的研究sec6突变体在孢子体时期的功能，我们用花粉特异性启动子LAT52来启动SEC6基因的表达，通过转基因技术得到了sec6突变体背景下的花粉回补植株。遗传分析表明回补植株的花粉传递率恢复到了80％左右，同时回补植株的花粉管在体外花粉萌发时能够恢复正常生长。在回补植株的长角果中有白色种子，幼苗发育迟缓且成熟植株矮化不能正常结实。统计数据显示白色种子和生长发育异常的幼苗占各自总数12％和14％，这符合孟德尔定律纯合体的比率(25％)。对异常幼苗的基因型分析结果证实它们是sec6突变体的纯合体后代（我们称之为PRsec6-1，PRsec6-2）。相比于野生型，SEC6在PRsec6中的RNA和蛋白水平明显下降。这些结果说明SEC6对于植物的生长发育是必需的。　　我们进一步对SEC6是否参与胞质分离过程进行了解析。相比于野生型，PRsec6在胚胎发育的不同时期出现了滞后甚至停止发育的现象，在胚胎中出现了细胞形态不规则和多核现象，这和keule突变体的表型相似。PRsec6叶片表皮细胞比野生型的要小，在PRsec6-1和PRsec6-2中，分别有5.2％(44/850)和3.1％(34/1100)的细胞出现了异常的细胞壁残端，是胞质分离异常的典型特征。在野生型表皮细胞中气孔由两个完全对称分布的保卫细胞包围形成，而在PRsec6叶片中大约有20％的气孔形态出现了异常。这些结果说明SEC6参与到了植物细胞的胞质分离过程。　　为了解析SEC6和KEULE在胞质分离过程中的细胞定位，我们通过转基因技术分别获得了35S-GFP-KEULE和35S-SEC6-GFP烟草BY-2转基因细胞。荧光观察发现SEC6和KEULE定位于细胞板上并参与到细胞板的整个形成过程。当细胞板生长至母细胞交接处时荧光非常强，但随着细胞板的成熟荧光信号开始消失。我们还创制了同时表达GFP-KEULE和SEC6-mCherry的转基因植株，通过共聚焦显微镜发现它们共定位于细胞板上，这说明SEC6和KEULE共同作用于胞质分离细胞板的形成过程。另外，通过酵母双杂交和体外GSTPull-down实验可知KEULE只与SEC6，而不与Exocyst复合体中其它已报道位于细胞板上的亚基(SEC8、SEC15b、Exo70A1和Exo84b)互作，说明KEULE和SEC6特异性互作从而调控细胞板的形成。　　PRsec6和keule突变体中根毛的生长发育也受到了影响，根毛出现短小肿大的表型。通过Promoter-GUS转基因可知SEC6和KEULE是组成性表达的蛋白，它们在根毛上也有很强的表达，这说明它们也可能共同作用于根毛的生长发育过程。　　本研究主要有两方面创新。第一，首次在植物中报道了Exocyst亚基SEC6和KEULE之间的互作。进一步实验结果显示SEC6是植物生长发育所必需的，且和KEULE一起参与植物的胞质分离过程。第二，SEC6-KEULE互作为胞质分离细胞板形成过程中膜融合的机理提供了一个新的假说:一方面在胞质分离的过程中，SEC6携带着完整的Exocyst复合体及其拴系囊泡靠近KEULE调控的SNARE复合体，从而介导囊泡与质膜的融合;另一方面SEC6-KEULE相互作用可能也参与调控SNARE复合体的组装过程。