脑出血(Intracerebral hemorrhage,ICH)是人类最常见的脑血管病,也是最难治疗的出血性脑卒中亚型,约占所有中风类型的13%-15%。在所有自发性脑出血当中,根据出血部位,可以分为颅内出血、蛛网膜下出血、硬脑膜外出血和硬脑膜下出血。由于颅内出血在人群发病分布更为广泛,因此作为焦点得到科研人员的关注。脑出血(ICH)是由于脑血管破裂而导致脑实质内血液渗漏。未得到有效控制的高血压是其主要可改变的危险因素,同时随着年龄的增长,脑出血发病几率会逐渐增加,成为导致ICH发病的主要病因。研究表明,脑出血后的神经功能损伤通常是由神经炎症反应,神经细胞凋亡和细胞毒性反应所致。大约80%的康复患者在ICH后6个月内不能够独立自主地活动,这些人将遭受终身神经功能缺陷的折磨。除脑出血后的运动功能障碍外,认知障碍也是最棘手的。因为脑出血最好发部位在基底节(纹状体),据报道,此部位的病变会导致显著的学习和记忆缺陷。骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)是一种糖基化磷蛋白,存在于所有体液和矿化组织的蛋白质基质中。其本身含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Rgd)结构域,结合各种整合素受体和CD 44变异体。因此既可以作为细胞附着蛋白,又可以作为细胞因子,通过包括整合素和CD44在内的多个受体向细胞传递信号。有研究发现在局灶性脑缺血损伤,蛛网膜下腔出血损伤,脊髓损伤,机械性脑损伤后中枢神经系统内的OPN表达水平能够明显提升。在脑缺血损伤的体外实验中,OPN对培养的神经元具有很好的保护作用,在脑缺血体内实验当中,OPN能够通过减少神经细胞凋亡,减少缺血性脑卒中小鼠的脑梗死面积。在机械性脑损伤中,OPN能够作用在神经元和神经胶质细胞,通过调节β1整合素蛋白和CD44,最终使海马区突触修复,对突触重组和功能恢复有积极影响。综上所述,OPN其作为神经保护剂具有非常好的应用前景,在神经系统中能发挥重要的作用。通过大量检索和阅读文献,在前期预实验工作的基础上,我们推测r-OPN颅内注射能够有效改善ICH大鼠的神经功能障碍的恢复,减少伤后神经细胞死亡,积极地影响突触可塑性,改善伤后大鼠的认知记忆功能障碍。其机制可能与PI3K-Akt-GS3Kβ通路介导有很大关联。为了证明我们的推测,本课题将以3部分的实验形式进行相关阐述。第一部分重组骨桥蛋白对脑出血大鼠的神经保护目的:证实重组骨桥蛋白减轻大鼠脑出血后所造成的神经功能障碍,提供神经保护作用。方法:将90只雄性成年SD大鼠随机分为三组:1)假手术组(Sham group);2)脑出血组(ICH group);3)脑出血+r-OPN治疗组(ICH+r-OPN)。通过自体取血100ml注入大鼠基底节,于造模成功后10分钟,通过立体定向仪向ICH大鼠侧脑室注射药物r-OPN,之后通过不同的神经功能评估方法,观察3个不同组别间的差异,已确定最终治疗效果。检测指标如下:1)HE染色观察ICH后24h损伤后脑组织病理形态变化和神经细胞存活情况;2)脑组织含水量来测定ICH后1-3天,伤侧半球脑组织水肿程度;3)mNSS评分评估ICH后1-5天,评估大鼠神经功能障碍情况;4)转棒试验通过大鼠伤后在转棒仪器停留时间长短,评估伤后大鼠神经运动恢复情况;5)Morris水迷宫中定位航行实验来判断伤后大鼠学习认知能力;6)Morris水迷宫中的空间探索实验来评估ICH伤后大鼠早期的记忆能力。应用Image Lab5.1及Image J等分析系统对实验结果进行测定分析。实验结果写成均数±标准差的形式,用统计软件SPSS 17.0分析,P<0.05则差异具有统计意义。结果:1.大鼠ICH模型的制备情况:观察ICH后模型大鼠,取大鼠脑组织观察血肿注入点,观察冠状面,发现有一明显血肿区域位于基底节尾状核邻近,并且血肿周围区域有局部脑组织损伤。通过HE染色观察伤后24小时不同组别之间脑组织形态学改变。Sham组的大鼠脑组织神经细胞数量丰富,分布匀称,组织间隙正常,胞浆均匀,胞核清晰可见,无炎性细胞浸润无血管扩张。ICH模型组观察发现,大量的神经细胞核固缩坏死,胞浆嗜酸性减弱。组织明显水肿,神经细胞排布不均,间隙明显增宽,同时有血管扩张,并伴有大量的炎性细胞浸润。经过r-OPN治疗后,脑组织中神经细胞固缩坏死的细胞数明显减少,组织水肿明显减轻;2.脑组织水含量测定:Sham组1-3天内脑组织水含量没有改变,ICH组中脑组织于伤后1-3天含水量显著增高,并在伤后第二天到达高峰(P<0.05)。r-OPN治疗后脑组织含水量明显低于ICH组,差异显著(P<0.05);3.ICH后神经功能评估:ICH组mNSS评分在伤后1-5天明显升高相对于Sham组,随着伤后时间推移略有下降,但是下降不明显(P<0.05)。与ICH组相比,r-OPN治疗后的大鼠mNSS评分降低,差异显著(P<0.05)。转棒试验发现ICH组的大鼠伤后1-5天在转棒停留时间明显低于Sham组,差异显著(P<0.05)。相对于ICH组,r-OPN组的大鼠在转棒停留时间明显延长,具有统计学意义(P<0.05);4.ICH后认知记忆功能的评估:Morris水迷宫中大鼠定位航行实验中,ICH组的大鼠伤后1,3,7天,逃避潜伏期相对于Sham组的大鼠在时间上明显延长,差异显著(P<0.05)。r-OPN组的大鼠逃避潜伏期时间相对于ICH组伤后大鼠的时间明显缩短,有统计学意义(P<0.05)。Morris水迷宫空间探索实验,在2min的时间内,ICH组的大鼠,穿越平台次数明显少于Sham组,差异显著(P<0.05)。r-OPN组的大鼠的穿越平台次数相对于ICH明显增多,有统计学意义;小结:采用自体血注射成功建立了大鼠ICH模型;大鼠ICH后导致脑组织水肿,神经运动功能障碍和认知记忆障碍;给予r-OPN治疗后,可以起到神经保护作用,减轻血肿周围脑组织损伤,改善脑水肿和ICH大鼠神经运动和认知记忆障碍。第二部分重组骨桥蛋白通过作用PI3K-Akt-GSK-3β信号通路减少脑血后神经功能障碍和细胞凋亡目的:通过PI3K-Akt-GSK-3β通路抑制剂Wortmannin的干预,探讨大鼠ICH后r-OPN能否通过PI3K-Akt-GSK-3β通路减少脑组织神经功能障碍和细胞凋亡。方法:120只雄性SD大鼠被随机分为四组:1)假手术组(Sham group);2)脑出血组(ICH group);3)脑出血+r-OPN治疗组(r-OPN group);4)脑出血+r-OPN+Wortmannin干预组(Wort group)。动物模型制作同第一部分,对下列指标进行检测:1)mNSS评分和转棒试验观察大鼠神经功能情况;2)末端脱氧核苷酸转移酶介导(DUTP)缺口末端标记(TUNEL)法检测细胞凋亡;3)免疫荧光分别观察受损脑组织内通路因子p-Akt和NeuN,GSK-3β和NeuN共聚焦结果4)Western-blot检测ICH后血肿周围区受损脑组织通路相关蛋白Akt,p-Akt,GSK-3β,p-GSK-3β,凋亡相关蛋白Bcl-2,Bax,cleaved caspase-3(CC3),caspase-3的表达。实验结果的测定记录及统计分析同第一部分。结果:1.神经功能评估结果:相对于Sham组大鼠,ICH组大鼠逃避潜伏期时间明显延长,转棒实验停留时间明显缩短,差异显著(P<0.05)。当给予r-OPN治疗后发现,r-OPN能够明显减少ICH所造成的神经运动功能损伤,逃避潜伏期明显缩短,转棒停留时间明显延长,有统计学意义(P<0.05)。当给予PI3K-Akt-GSK-3β通路抑制剂Wortmannin后,观察发现相对于r-OPN组大鼠逃避潜伏期时间延长,转棒停留时间缩短,差异显著(P<0.05)。Wortmannin逆转了r-OPN改善神经功能障碍的能力;2.TUNEL/DAPI荧光显示伤后24h血肿周围损伤脑组织凋亡阳性细胞:绿色荧光TUNEL阳性细胞,蓝色荧光标记DAPI细胞核。Sham组绿色荧光表达特别少,提示凋亡阳性细胞少。ICH组在镜下视野发现大量绿色荧光凋亡阳性细胞,与Sham组相比较明显增多(P<0.05)。与ICH组相比,r-OPN组绿色荧光明显减少,说明凋亡阳性细胞明显减少。当给予PI3K-Akt-GSK-3β通路抑制剂Wortmannin后,绿色荧光显著增强,凋亡阳性细胞明显增多(P<0.05);3.p-Akt和神经元标记物Neu N的免疫荧光共聚情况。绿色荧光标记NeuN,红色荧光标记p-Akt,蓝色荧光标记DAPI细胞核。观察三者共聚情况。Sham组发现绿色荧光表达较多,红色荧光有一定量的表达。三者共聚后有一定量橘黄色的重叠。ICH组,红色荧光明显减少,红色绿色荧光共聚的橘黄色重叠较少,提示ICH后能够减少p-Akt的表达。r-OPN组红色荧光明显大量增加,共聚后出现大量橙黄色重叠,提示r-OPN能够激活p-Akt。当给予PI3K-Akt-GSK-3β通路抑制剂Wortmannin后,发现红色荧光明显减少,同时三种颜色共聚后橘黄色荧光也明显减少。提示p-Akt表达被抑制;4.p-GSK-3β和神经元标记物NeuN的免疫荧光共聚情况。绿色荧光标记Neu N,红色荧光标记p-GSK-3β,蓝色荧光标记DAPI细胞核。观察三者共聚情况。Sham组发现绿色荧光表达较多,红色荧光表达非常少。三者共聚后有少量橘黄色的重叠。ICH组,红色荧光明显增多,红色绿色荧光共聚的橘黄色重叠较多,提示ICH后能够增加p-GSK-3β的表达。r-OPN组红色荧光能够显著减少,共聚后只有少量橙黄色重叠,提示r-OPN能够抑制p-GSK-3β激活。当给予PI3K-Akt-GSK-3β通路抑制剂Wortmannin后,发现红色荧光明显增强,同时三种颜色共聚后橘黄色荧光也明显增多。提示p-GSK-3β能够被重新激活;5.p-Akt,Akt的免疫印迹分析结果:Sham组p-Akt蛋白有一定量的表达,ICH后p-Akt与Akt的比值低于Sham,差异显著(P<0.05)。给予r-OPN治疗后,发现相对于ICH组,p-Akt与Akt的比值显著升高(P<0.05)。但是当给予PI3K-Akt-GSK-3β通路抑制剂Wortmannin后,发现p-Akt与Akt蛋白比值降低相对于r-OPN治疗组,差异显著(P<0.05);6.p-GSK-3β,GSK-3β的免疫印迹分析结果:Sham组p-GSK-3β蛋白表达量较少,ICH后p-GSK-3β与GSK-3β的比值高于Sham,差异显著(P<0.05)。给予r-OPN治疗后,发现相对于ICH组,p-GSK-3β与GSK-3β的比值显著降低(P<0.05)。但是当给予PI3K-Akt-GSK-3β通路抑制剂Wortmannin后,发现p-GSK-3β与GSK-3β蛋白比值增高相对于r-OPN治疗组,差异显著(P<0.05);7.Bax/Bcl-2的免疫印迹分析:ICH组Bax/Bcl-2的比值明显高于Sham组,差异显著(P<0.05)。当给予r-OPN治疗后发现Bax/Bcl-2的比值明显降低,相对于ICH组有统计学意义。但是当给予PI3K-Akt-GSK-3β通路抑制剂Wortmannin后,相比较于r-OPN组,Bax/Bcl-2比值会增高,差异显著(P<0.05);8.CC3(cleaved caspase-3)与caspase-3免疫印迹分析:Sham组CC3蛋白表达量很少。ICH后观察发现CC3蛋白表达明显增多,与Sham组相比较差异显著(P<0.05)。给予r-OPN治疗发现CC3蛋白表达量明显降低,与ICH组相比较具有统计学意义(P<0.05)。但是当给予PI3K-Akt-GSK-3β通路抑制剂Wortmannin后,相比较于r-OPN组,CC3蛋白表达量会增多,差异显著(P<0.05)。各组之间caspase-3蛋白表达无明显差异(P<0.05)。小结:ICH后血肿区周围受损脑组织会存在细胞凋亡,PI3K-AktGSK-3β通路被抑制。给与r-OPN治疗,并通过抑制剂Wortmannin干预,能够证实r-OPN能够通过激活p-Akt,抑制p-GSK-3β,最终减少重要的凋亡相关蛋白的表达,减少神经细胞凋亡,起到改善神经功能障碍的作用。第三部分重组骨桥蛋白通过作用PI3K-Akt-GSK-3β信号通路改善突触可塑性对脑出血后认知记忆障碍提供保护目的:r-OPN治疗ICH大鼠,观察脑损伤后海马区突触可塑性相关蛋白的改变,同时给予PI3K-Akt-GSK-3β通路抑制剂Wortmannin,明确r-OPN是否能够通过该通路改善突触可塑性,最终提高了ICH大鼠的认知记忆能力。方法:90只雄性SD大鼠被随机分为四组:1)假手术组(Sham group);2)脑出血组(ICH group);3)脑出血+r-OPN治疗组(r-OPN group);4)脑出血+r-OPN+Wortmannin干预组(Wort group)。在术后对下列指标进行检测:1)通过Morris水迷宫中定位航行实验来判断伤后大鼠的学习认知能力,Morris水迷宫中的空间探索实验来评估ICH伤后大鼠早期的记忆能力。2)Western-blot检测ICH后1,3,7天大鼠海马区相关通路蛋白Akt,p-Akt,GSK-3β,p-GSK-3β,突触可塑性相关蛋白synaptophysin(Syn),PSD-95,microtubule-associated protein2(MAP-2)。3)免疫荧光检测伤后第3天海马CA1区突触可塑性相关因子Syn,PSD-95在各组之间的表达情况。实验结果的测定记录及统计分析同第一部分。结果:1.Morris水迷宫评估结果:ICH后1-3天大鼠逃避潜伏期时间明显延长,穿越平台次数明显减少,相对于Sham组(P<0.05)。给予r-OPN治疗后,能够明显减少逃避潜伏期时间,同时穿越平台次数明显增多,差异显著(P<0.05)。当给予PI3K-Akt-GSK-3β通路抑制剂Wortmannin后,观察发现相对于r-OPN组的大鼠逃避潜伏期时间延长,穿越平台次数减少,差异显著(P<0.05)。Wortmannin削弱了r-OPN改善神经ICH大鼠认知记忆的能力;2.p-Akt,Akt的免疫印迹分析结果:观察伤后1,3,7天不同组间p-Akt与Akt表达情况sham组p-Akt蛋白有一定量的表达,ICH后p-Akt与Akt的比值低于Sham,差异显著(P<0.05)。给予r-OPN治疗后,发现相对于ICH组,p-Akt与Akt的比值显著升高,在第三天增高最显著(P<0.05)。但是与r-OPN治疗组相比,当给予PI3K-Akt-GSK-3β通路抑制剂Wortmannin后,p-Akt与Akt蛋白比值降低,差异显著(P<0.05);3.p-GSK-3β,GSK-3β的免疫印迹分析结果:观察伤后1,3,7天不同组间p-GSK-3β与GSK-3β表达情况sham组p-GSK-3β蛋白表达量较少,ICH后p-GSK-3β与GSK-3β的比值高于Sham,差异显著(P<0.05)。与ICH组相比,给予r-OPN治疗后,p-GSK-3β与GSK-3β的比值降低,在第三天降低最显著(P<0.05)。但是当给予PI3K-Akt-GSK-3β通路抑制剂Wortmannin后,p-GSK-3β与GSK-3β蛋白比值增高,与r-OPN治疗组比较差异有统计学意义(P<0.05);4.MAP-2蛋白免疫印迹分析:观察伤后1,3,7天不同组间MAP-2表达情况。Sham组MAP-2蛋白有一定程度的表达。ICH后观察发现MAP-2蛋白表达明显减少,与Sham组相比较差异显著(P<0.05)。给予r-OPN治疗后MAP-2蛋白表达量明显增加,并且在第三天表达量最高,与ICH组相比较具有统计学意义(P<0.05)。但是当给予PI3K-Akt-GSK-3β通路抑制剂Wortmannin后,MAP-2蛋白表达量会减少,与r-OPN组相比差异显著(P<0.05);5.Syn蛋白免疫印迹分析:观察伤后1,3,7天不同组间Syn表达情况。Sham组Syn蛋白有一定程度的表达。ICH后观察发现Syn蛋白表达明显减少,与Sham组相比较差异显著(P<0.05)。给予r-OPN治疗发现Syn蛋白表达量明显增加,并且在第三天表达量最高,与ICH组相比较具有统计学意义(P<0.05)。但是当给予PI3K-Akt-GSK-3β通路抑制剂Wortmannin后,Syn蛋白表达量会减少,与r-OPN组相比差异显著(P<0.05);6.PSD-95蛋白免疫印迹分析:观察伤后1,3,7天不同组间PSD-95表达情况。Sham组PSD-95蛋白有一定程度的表达。ICH后观察发现PSD-95蛋白表达明显减少,与Sham组相比较差异显著(P<0.05)。给予r-OPN治疗发现Syn蛋白表达量明显增加,并且在第三天表达量最高,与ICH组相比较具有统计学意义(P<0.05)。但是当给予PI3K-Akt-GSK-3β通路抑制剂Wortmannin后,PSD-95蛋白表达量会减少,与r-OPN组相比差异显著(P<0.05);7.Syn/DAPI荧光显示ICH伤后第3天海马CA1区突触可塑性蛋白定位表达情况:红色荧光代表突触可塑性相关因子Syn,蓝色荧光标记DAPI细胞核。Sham组有一定量的红色荧光表达。但是伤后观察ICH组发现红色荧光明显减少,证明Syn在海马CA1区所表达量明显减少。r-OPN组红色荧光明显增多,提示经过r-OPN治疗能够明显增加Syn的表达。当给予PI3K-Akt-GSK-3β通路抑制剂Wortmannin后,红色荧光表达量较低,PSD-95表达减少。当通路被抑制后,提示r-OPN不能够改善突触可塑性;8.PSD-95/DAPI荧光显示ICH伤后第3天海马CA1区突触可塑性蛋白定位表达情况:红色荧光标记突触可塑性相关因子PSD-95,蓝色荧光标记DAPI细胞核。Sham组有一定量的红色荧光表达。但是伤后观察ICH组发现红色荧光明显减少,证明PSD-95在海马CA1区所表达量明显减少。r-OPN组红色荧光明显增多,提示经过r-OPN治疗能够明显增加PSD-95的表达。当给予PI3K-Akt-GSK-3β通路抑制剂Wortmannin后,红色荧光表达量较低,PSD-95表达减少。提示当通路被抑制后,r-OPN不能够改善突触可塑性。小结:大鼠ICH早期,突触可塑性相关蛋白就会受到影响,在海马CA1区表达降低,r-OPN可通过激活PI3K-Akt-GSK-3β信号通路改突触可塑性,对脑出血后认知记忆障碍提供保护。结论:ICH后r-OPN能够发挥神经保护作用,改善认知记忆功能障碍,或许与激活PI3K-Akt-GSK-3β通路减少神经细胞凋亡,改善突触可塑性有关。