手性环氧化物和邻二醇是一类高附加值的多功能合成子,广泛应用于医药、农药和精细化工品的合成。环氧化物水解酶（epoxide hydrolases,EHs）能特异性水解外消旋或内消旋环氧化物制备手性环氧化物和邻二醇。但对映选择性偏低、产物抑制和稳定性低等缺陷限制了EHs的工业化应用。挖掘新型EHs或对现有EHs进行分子改造是突破该酶产业发展瓶颈的关键。本论文以宇佐美曲霉Aspergillus usamii E001作为出发菌株,克隆并表达了一种环氧化物水解酶AuEH2,构建并优化了双相催化体系下该酶的水解工艺,应用半理性设计策略改造了AuEH2的对映选择性,获得优良突变酶并应用于手性环氧化物和邻二醇的制备。本研究将促进AuEH2及其突变体的产业化生产和应用,并为其它酶的分子改造提供新思路。（1）采用RT-PCR和THSO-PCR技术,从A.usamii中克隆一种新型Aueh2基因,其开放阅读框为1188 bp,共编码395个氨基酸。生物信息学分析表明AuEH2与已报道EHs的最高同源性为58.2%,其包含α/β水解酶超家族特有的HGXP、S_mXNuXS_mS_m和GGHFAALE保守区域,推测其催化三联体为D¹⁹¹-H³⁶⁹-E³⁴³和保守质子供体为Y²⁴⁹和Y³¹²;AuEH2三维结构由N末端卷曲结构域(M^1P84)、核心结构域(Q^85L212和P^317K395)和“帽子”结构域(S^247F316)三部分组成,属于微粒体EH亚家族。（2）借助pET28a（+）质粒实现Aueh2基因在大肠杆菌BL21（DE3）中高效异源表达。以环氧苯乙烷1a为底物,最佳诱导条件下的比活力最高达1440 U·L^-1（35℃）,重组菌E.coli/Aueh2的比活力为533 U·g^-1 cdw（25℃）为野生菌A.usamii E001的400倍,可溶性AuEH2占重组菌总蛋白的35.7%。SDS-PAGE分析其表观分子量为44.3 kDa,纯酶比活力高达9.7 U·mg^-1,其最适pH和温度分别为7.0和35℃,在pH 6.5⁷.5和25⁴0℃条件下具有较高催化活性和稳定性。针对（R）-1a和（S）-1a,AuEH2的专一性常数比值(k^R_cat/K_m^R)/(k^S_cat/K_m^S)为8.9,表明其优先水解（R）-1a,区域选择性系数β_R和β_S分别为98.3%和98.8%,表明其专一性攻击C_β。分子对接模拟结果表明（R）-1a的氧原子更易与Y³¹²形成氢键而质子化,且C_β更易被D¹⁹¹亲核攻击,从而被优先水解。（3）不同温度条件下,重组菌E.coli/Aueh2水解动力学拆分rac-1a制备（S）-1a的ee_s>99%,产率为38%（10℃）、32%（20℃）和27.5%（35℃）,E值为24.2（10℃）、19.3（20℃）和10.3（35℃）,表明酶促反应温度是影响该酶对映选择性的关键因素之一。底物谱分析表明E.coli/Aueh2水解单取代环氧化物1a¹7a的比活力为119¹143 U·g^-1 cdw,E值为2.1⁹5.9;水解芳香族环氧乙烷保留（S）-1a⁶a生成邻二醇（R）-1b⁶b,水解缩水甘油醚衍生物保留（R）-8a¹4a生成邻二醇（S）-8b¹4b,水解脂肪族环氧乙烷保留（S）-15a生成邻二醇（R）-15b,对内消旋环氧化物18a无活性,表明reAuEH2具有广阔的底物谱。（4）在单水相体系中,AuEH2水解1a具有高底物浓度耐受性（>1 M）,但存在产物抑制作用（<300 mM）。正己醇/缓冲液双相催化体的最佳工艺条件为:相体积比为1:1（v/v）,S/E比值为6（w/w）和反应温度25℃。在此条件下,实现了高浓度环氧苯乙烷的水解动力学拆分。与单水相体系相比,底物浓度从24 g·L^-1（200 mM）提高至120 g·L^-1（1M）,提高5倍,时空产率从3.15 g·L^-1·h^-1提高至20.3 g·L^-1·h^-1,提高6.4倍;（S）-1a的ee_s值从36.8%提高至98.2%。研究表明该双相催化体系能有效解除产物抑制,从而显著提高的底物浓度和生产效率。（5）基于计算机辅助设计选定底物结合口袋中的8个关键氨基酸(K¹⁹⁵、A²¹⁴、Y²¹⁶、S²⁴⁷、A²⁵⁰、N³¹⁵、L³⁴⁴和V³⁴⁵)进行定点和迭代饱和突变,构建约750个转化子的“smart”突变体文库。以1a为模式底物,高通量筛选获得11个对映选择性提高的突变体,E值从16.2提高至18.7²02.2（25℃）,提高1.2¹2.3倍。其中,AuEH2^A250I和AuEH2^A250I/A214C催化rac-1a的E值分别为48.2和202.2,比活力分别为10.7和16.7 U·mg^-1（25℃）。与AuEH2相比,AuEH2^A250I和AuEH2^A250I/A214C动力学拆分rac-1a制备（S）-1a的产率分别从39.8%提高至43.8%和49.1%（理论产率为50%）,产物（R）-苯基乙二醇的ee_p分别从65.8%提高至78.5和95.5%。动力学常数结果表明,突变体AuEH2^A250I和AuEH2^A250I/A214C对映选择性的提高主要是通过显著提高（R）-1a的k_cat值和（S）-1a的K_m来实现。（6）底物谱分析表明,突变体水解环氧化物1a¹5a的比活力从119¹143 U·g^-1 cdw提高至189¹400 U·g^-1 cdw,E值从2.1⁹5.9提高至16.2³41.7（25℃）,为原酶的2.1¹8倍。针对1a、3a⁶a、8a、11a¹3a和15a的10种环氧化物的E值均>30,其中突变体对1a（E>200）、3a（E=39.9）、4a（E>200）、6a（E=37.4）、10a（E=18.3）和12a（E=35.7）为目前报道最高。利用优良突变体水解动力学拆分rac-1a¹5a制备手性环氧化物的ee_s和产率为97.1⁹9.9%和36.3⁴9.1%,以及手性邻二醇ee_p为56.7⁹5.5%,具备工业化应用的潜力。