研究背景： 冠状动脉粥样硬化心脏病(coronary atherosclerosis heart disease，CHD)是严重威胁人类健康的疾病，其病理基础是动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)。近年来的研究表明，内皮功能障碍是AS的始动因素，贯穿AS发生、发展的全过程。多种病理因素(如机械、化学、免疫等)直接损伤内皮细胞，使内皮细胞释放的血管活性物质和细胞因子之间的平衡紊乱，进一步促进血管收缩、血管通透性增加、血小板聚集、脂质氧化、平滑肌细胞增殖、白细胞粘附和血栓形成最终引起AS。因此，保护血管内皮、防治内皮功能障碍已成为防治AS的研究重点。 血浆同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)水平升高是引发AS病变的主要原因之一，被认为是AS的独立危险因子。Hcy通过损伤内皮细胞、促进平滑肌细胞增殖和细胞外基质重构、激活炎症反应等各个阶段促进AS形成。其中，Hcy对内皮细胞损伤一直都是高同型半胱氨酸血症致AS的研究重点。研究发现Hcy主要是通过抑制内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)活性，使一氧化氮(nitric oxide，NO)产生减少、生物活性下降，引起血管内皮功能障碍，最终导致AS发生。但是，Hcy损伤内皮细胞、导致AS发生的内在机制尚未完全阐明。 Caveolae是在细胞质膜上的50-100 nm大小的小凹样结构，存在于体内多种细胞类型中，特别在内皮细胞中富集。Caveolin-1是caveolae的特征性结构蛋白，保持caveolae的Ω形态。Caveolae和caveolin-1参与多种细胞功能，包括多种运输过程如跨胞运输、胞吞和胞吐作用、维持脂质稳态、维持糖类和蛋白代谢平衡并调节多种信号传导通路，在AS的发展中起重要作用。研究发现，caveolin-1可以抑制或诱导eNOS的活性，这种矛盾现象引起学术界的兴趣。但是，Hcy损伤内皮细胞过程中caveolin-1与eNOS的变化及机制尚未阐明。 通心络(Tongxinluo，TXL)是依据络病理论将不同类别通络药物有机组合研制而成的中药复方制剂。通心络由人参、全蝎、蜈蚣、蝉蜕、水蛭、土鳖虫、赤芍、降香和冰片等药物组成，以络虚通补药为主，辅以虫类化瘀通络药、搜风通络药和辛香通络药组方。该方剂具有益气活血、搜风通络之功效。现代医学研究证实TXL通过抗氧化应激、抗血小板、抗凝、抗炎等途径直接及间接保护内皮细胞功能，同时TXL具有调脂、协同降压、降糖、降Hcy等延缓AS进展的功能。 尽管临床观察及部分动物实验发现TXL可通过保护内皮细胞防治AS，但目前具体机制尚未完全明了。迄今为止，国内外尚无关于TXL对Hcy损伤内皮细胞功能的保护作用以及NO/Caveolin-1机制的研究。鉴于NO/Caveolin-1在AS发病机制中的重要性，我们设想以此为突破口，探讨TXL抗AS的新的作用机制。 研究目的： 本研究通过建立Hcy损伤人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)模型，观察TXL对内皮细胞的保护作用，以阿托伐他汀(atorvastatin，ATV)为对照药物，探讨NO/caveolin-1在此过程中的作用，为TXL应用于临床防治AS提供新的实验及理论依据。 方法： 1.HUVECs培养及鉴定：新鲜脐带取自健康孕妇，分离HUVECs，培养，传代，取第2-4代的细胞用于实验。取第2代细胞采用流式细胞术检测细胞表面CD34抗原表达鉴定内皮细胞。 2.噻唑蓝(MTT)法检测细胞活力：观察不同浓度Hcy、TXL和ATV作用于HUVECs48 h后的细胞活力。 3.NO、MDA水平和SOD活性检测：将细胞随机分成4组：1)对照组；2) Hcy组(0.5 mmol/L)；3)TXL组(TXL5 mg/ml+Hcy0.5 mmol/L)；4) ATV组(ATV10μmol/L+ Hcy0.5 mmol/L)．处理48h后，取各组细胞培养液，分别检测各组的NO、MDA水平和SOD活性。 4.荧光实时定量RT—PCR(Real—time RT—PCR)方法检测eNOS和caveolin-1的mRNA表达。采用与方法4相同分组、药物剂量作用48h后，收集细胞，提取总RNA，逆转录为cDNA，进行Real time PCR检测eNOS、caveolin-1的mRNA表达水平。 5.免疫印迹法(Western Blot)检测eNOS和caveolin-1的蛋白表达。采用与方法4相同分组、药物剂量作用48 h后，收集细胞，提取总蛋白，进行Western Blot检测eNOS、caveolin-1的蛋白表达水平。 6.数据以均数±标准差(x±s)表示，所有实验重复3次以上。统计学处理采用SPSS13.0软件包。组间比较用单因素方差分析(One way ANOVA)，多重比较用LSD法。P<0.05表示差别具有统计学意义。 结果： 1.HUVECs培养及鉴定结果：形态学上内皮细胞分布均匀，单层生长，形态为多角形、梭形或椭圆形，呈铺路石样镶嵌排列；利用流式细胞术检测细胞表面CD34抗原发现，99.6％细胞表达CD34。鉴定结果为内皮细胞。 2.MTT法检测结果： 1)加入6个不同浓度的Hcy(0.1～1 mmol/L)处理48h后发现，随着Hcy浓度增大，细胞活力逐渐减弱，与正常组之间的差异具有统计学意义(P<0.05)； 2)在Hcy(0.5 mmol/L)处理的同时加入8个不同浓度的TXL(1～8 mg/ml)处理48h后发现，随着TXL浓度增大，细胞活力逐渐增强，与Hcy正常组之间的差异具有统计学意义(P<0.05)； 3)在Hcy(0.5 mmol/L)处理的同时加入4个不同浓度的ATV(0.1～100μmol/L)处理48h后发现，随着ATV浓度增大，细胞活力逐渐增强，与Hcy正常组之间的差异具有统计学意义(P<0.05)。 3.NO水平检测结果发现Hcy组HUVECs的NO水平低于正常组，差异具有统计学意义(P<0.05)；TXL组HUVECs的NO水平高于Hcy组之间，差异具有统计学意义(P<0.05)，但与ATV组差异无统计学意义(P>0.05)。 4.SOD活性和MDA水平检测结果发现Hcy组HUVECs的SOD活性明显低于正常组，MDA水平明显高于正常组，差异均具有统计学意义(P<0.05)；TXL组的SOD活性明显高于Hcy组，MDA水平明显低于Hcy组，差异具有统计学意义(P<0.05)，但与ATV组差异无统计学意义(P>0.05)。 5.荧光实时定量RT—PCR方法检测eNOS和caveolin-1的mRNA表达结果发现0.5mmol/L Hcy可显著抑制HUVECs的eNOS mRNA表达，诱导caveolin-1 mRNA表达，与正常组之间差异具有统计学意义(P<0.05)；5 mg/ml TXL可显著提高Hcy处理的HUVECs的eNOS mRNA表达，抑制caveolin-1 mRNA表达，差异具有统计学意义(P<0.05)，与ATV组差异无统计学意义(P>0.05)。 6.免疫印迹法检测eNOS和caveolin-1的蛋白表达结果发现0.5 mmol/LHcy可显著抑制HUVECs的eNOS蛋白表达，诱导caveolin-1蛋白表达，与正常组之间差异具有统计学意义(P<0.05)：5 mg/ml TXL可显著提高Hcy处理的HUVECs的eNOS蛋白表达，抑制caveolin-1蛋白表达，差异具有统计学意义(P<0.05)，与ATV组差异无统计学意义(P>0.05)。 结论： 1.Hcy可能通过氧化应激、破坏NO系统，导致内皮细胞活力下降和内皮功能损伤。 2.TXL可能通过提高SOD活性，清除氧自由基并维持NO系统平衡从而保护内皮功能。 3.Hcy可促进HUVECs caveolin-1的基因和蛋白表达，抑制eNOS的基因和蛋白表达，从而减少NO的产生。 4.TXL可促进HUVECs eNOS的基因和蛋白表达，抑制caveolin-1的基因和蛋白表达进而调节eNOS活性，从而促进NO的产生。