研究背景和目的:胃癌位列世界上常见的恶性肿瘤之一,据统计,胃癌在最常见的恶性肿瘤中排名第四。中、日、韩等东亚国家的发病率高于欧美,2017年我国流行病学统计结果提示我国胃癌发病率及死亡率均居第二位,每年新增胃癌病例数约40%发生在中国。男女发病率之比约2:1,发病年龄高峰为50~60岁,是严重危害人民身体健康的疾病。诸多因素导致胃癌地域分布差别的不均一性,其中环境是导致这一差异的重要因素。现今,随着医学模式从单一的生物医学模式转变为生物-心理-社会模式,社会心理因素对肿瘤的影响愈发引起众多学者关注。流行病学研究显示,社会心理压力可以促进癌症的发生和发展,并降低癌症患者五年生存率,但其作用机制仍不清楚。近年来,心理干预和免疫治疗已构建为癌症综合治疗的重要组分,但鉴于缺乏显效的治疗靶点,临床心理干预的有效性尚未达成一致。因此,深入研究精神心理应激如何引发胃癌发生、促进其发展以及转归调控,从而为应激相关胃癌的防治提供了新的方向,也是目前亟待解决的重要问题之一。机体感受应激刺激后,发生相应的适应性反应并激活交感肾上腺髓质系统(SAM)释放儿茶酚胺类等交感神经递质,对肿瘤细胞生长、微环境血管生成实施影响。诸多研究及临床证据亦表明SAM的活化、儿茶酚胺类神经递质水平的增高对多种实体肿瘤的生长、转移均有促进效应,而儿茶酚胺类神经递质发挥其诸多生理效应是经由结合并激活细胞表面的β肾上腺素能受体(ADRB)将胞外的信息传递至胞内从而引发其后续一系列效应。近年来诸多体外研究证实β肾上腺素能受体阻断剂可抑制乳腺癌、口腔癌和前列腺癌细胞的迁移及侵袭。因此有必要研究机体在慢性应激状态下,胃癌细胞表面的β肾上腺素能受体活化后对其发挥哪些生物学调控效应。本研究首先通过检测胃癌组织及胃癌细胞株中各型ADRB的表达水平,从而进一步确立何种ADRB的激活介导了儿茶酚胺类神经递质对胃癌的生长调控。从而着重研究该类ADRB的活化通过何种方式促进胃癌细胞的生长、转移。并通过构建慢性应激模型,来深入研究各型ADRB激动剂、阻断剂及ADRB2干扰在这一模型中对胃癌的发展、转移是否发挥进一步影响。这样不仅可以明确慢性应激状态能否对胃癌的发展、转移实施影响,而且更可为临床治疗胃癌、改善病患预后提供新的靶点。研究方法:1.首先RT-PCR验证各型ADRB在人胃粘膜细胞、各胃癌细胞系表达情况,Western-blot进一步验证。2.临床标本进一步验证胃癌组织中ADRB2的表达与临床特征关系。3.根据验证结果,利用体内、体外实验方法评价可能受ADRB2影响的胃癌生物学功能;4.不同浓度外源性ADRB激动剂、阻断剂对胃癌细胞增殖能力的影响,通过CCK8细胞增殖实验、平板集落形成实验、Edu实验、流式细胞技术检测细胞周期、凋亡细胞比例等实验方法,体外检测活化及阻滞ADRB信号通路对胃癌细胞系增殖及存活能力的影响。构建sh-ADRB2慢病毒质粒、包装纯化慢病毒;通过ADRB2干扰胃癌细胞系进一步验证ADRB2信号通路对肿瘤细胞增殖能力的调控;分析正常胃粘膜细胞株和胃癌细胞株胞内环磷酸腺苷(cAMP)水平;阻断及干扰ADRB2后胃癌细胞内cAMP变化;利用Western-blot检测胞内与细胞增殖、核转录相关的关键蛋白JNK、ERK、AP-1、NFκB、CREB、STAT3的表达情况,以及使用信号通路抑制剂观察是何种信号通路介导了上述作用,进一步机制层面进行验证。5.单纯慢性应激状态对裸鼠皮下成瘤能力、机体一般状态、血清激素水平的影响;6-OHDA选择性损毁小鼠外周交感神经后,观察慢性应激对裸鼠体内成瘤能力的影响。激动和阻滞ADRB信号后对慢性应激状态下裸鼠体内成瘤能力的影响、ADRB1是否参与其中发挥效应;sh-ADRB2细胞系裸鼠皮下成瘤能力的改变。这些结果与体内HPA轴持续激活的关系;采用免疫组织化学染色和TUNEL分析观察体内胃癌细胞存活能力的调节。6.建立尾静脉注射转移瘤模型:验证慢性应激状态是否通过ADRB2影响胃癌细胞株在裸鼠体内的侵袭、转移能力。Western-blot进一步验证小鼠胃癌组织中与转移、侵袭相关VEGF、MMP-2、MMP-7、MMP-9蛋白表达情况。结果:1.ADRB2在胃癌中特异性高表达;胃癌组织中ADRB2的表达水平与肿瘤的大小、病理分化程度、临床分期、淋巴结转移相关。2.慢性应激状态下,儿茶酚胺类物质能够促进胃癌发展、转移,并且这些促进效应通过活化ADRB2信号实现。3.在体外实验中,我们采用双向调控ADRB2的活性,证实了ADRB2与配体结合后通过激活ERK1/2,JNK MAPK信号通路及活化NF-κB,AP-1,CREB,STAT3等转录因子,从而调控胃癌细胞系的增殖和存活。4.ADRB2通过调控CyclinD1/CDK4/CDK6/p-Rb蛋白表达水平,影响胃癌细胞周期的进程;ADRB2通过影响Bcl-2家族、caspase-3蛋白的表达,从而介导胃癌细胞凋亡水平的调控。5.慢性应激状态可促进胃癌细胞体内增殖、转移能力。ADRB2阻滞剂可干扰胃癌细胞株体内成瘤能力,并在一定程度上对抗慢性应激对移植瘤的促生长作用。6.慢性应激致ADRB2信号通路激活后,移植瘤组织中VEGF、MMP2、MMP7、MMP9的表达均增强,且儿茶酚胺类激素可以增强转移相关蛋白的表达,导致了血管形成、转移能力的增加,从而促进肿瘤的生长、播散。ADRB2激动剂能够明显促进胃癌细胞在裸鼠体内肝肺转移能力,ADRB2阻滞剂能够明显抑制这种转移能力。7.ADRB2阻滞后可激活凋亡信号通路,从而促使胃癌细胞凋亡,继而衰减了胃癌细胞的体内成瘤能力。结论:本课题从体外胃癌细胞系、慢性应激动物实验模型和临床标本三个方面,首次证明了慢性应激状态下诱导ADRB2信号传导途径的激活在胃癌进展和转移中起关键作用。在实验中我们发现,ADRB2的表达水平同肿瘤的大小、病理分化程度、临床分期正相关。激活ADRB2信号通路能够增强胃癌细胞系体外增殖、侵袭能力以及体内成瘤能力,而阻滞、干扰ADRB2可以抑制胃癌细胞的增殖、促进胃癌细胞凋亡;ADRB2信号激活后可引发胞内cAMP的过度聚集,从而激活ERK1/2,JNK MAPK通路和活化NF-κB,AP-1,CREB,STAT3等转录因子从而促进胃癌细胞的增殖及存活。以上研究为更好研究慢性应激等外部环境因素影响胃癌进展、转移提供理论基础和依据,同时也提示临床应用ADRB2阻滞剂可作为治疗胃癌一个新策略。