背景:骨膜蛋白(periostin,POSTN)也被称为成骨细胞特异性因子-2(osteoblast-specific factor 2,OSF-2),是由成骨细胞分泌的一种多功能胞外基质蛋白。据文献报道其在胰腺癌、卵巢癌和前列腺癌等多种不同类型的肿瘤中高表达,并由此成为恶性肿瘤转移的候选基因之一。研究显示骨膜蛋白的高表达与非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer NSCLC)的不良预后密切相关。此外骨膜蛋白还可影响肿瘤细胞对化疗的敏感性,卵巢癌及直肠癌基础研究中表明骨膜蛋白可激活某些信号通路而导致化疗耐药。而骨膜蛋白与非小细胞肺癌顺铂(Cisplatin,CDDP)耐药之间的关系及其可能的机制,至今尚未有学者探讨和研究。基于此,本课题系统探讨了骨膜蛋白在非小细胞肺癌顺铂耐药中的作用及其相关的作用机制。第一部分,我们通过梯度增加顺铂给药剂量,构建了人非小细胞肺癌顺铂耐药细胞株A549/CDDP;并分析耐药细胞株A549/CDDP与亲本细胞株A549中骨膜蛋白的表达情况。初步探讨了骨膜蛋白的表达与人非小细胞肺癌顺铂耐药之间的相关性。第二部分,通过构建骨膜蛋白过表达载体,在体外研究了过表达骨膜蛋白对顺铂诱导的A549细胞部分生物学行为,如细胞的增殖及细胞周期、细胞凋亡等的影响;同时研究了抑制凋亡的重要信号通路Stat3/survivin在其中发挥的作用,进一步探讨其可能涉及的作用机制。第三部分,首先在耐药细胞株A549/CDDP上,通过沉默骨膜蛋白的表达观察细胞相关生物学行为的改变,探讨沉默骨膜蛋白是否可以在体外逆转非小细胞肺癌顺铂耐药的发生及相关作用机制;然后通过建立裸鼠非小细胞肺癌异体移植瘤模型,在体内进一步探讨沉默骨膜蛋白的表达对非小细胞肺癌顺铂耐药的影响。第一部分骨膜蛋白与非小细胞肺癌顺铂耐药的相关性分析目的:本研究的目的是通过梯度增加顺铂给药剂量,构建人非小细胞肺癌顺铂耐药细胞株A549/CDDP;并分析耐药细胞株A549/CDDP与亲本细胞株A549中骨膜蛋白的表达情况。初步探讨骨膜蛋白的表达与人非小细胞肺癌顺铂耐药之间的相关性。方法:对体外培养的A549细胞给予不同浓度的顺铂刺激,并通过MTT法计算其半数抑制率(IC50),然后采用梯度增加顺铂剂量的方法构建A549的顺铂耐药细胞株A549/CDDP。检测不同浓度顺铂作用下A549细胞中骨膜蛋白的m RNA及蛋白表达情况;并比较两株细胞中骨膜蛋白的m RNA及蛋白表达情况,研究骨膜蛋白与非小细胞肺癌顺铂耐药的相关性。统计方法采用单因素方差分析检验。结果:1采用梯度增加顺铂剂量的方法,最终获得在20μM的含顺铂培养基中稳定增长并持续增殖的细胞株,即为顺铂耐药细胞株A549/CDDP。A549/CDDP及A549的半数抑制浓度(IC50)分别为25μM和10μM,A549/CDDP对顺铂的耐药性明显增加。2采用0~30μmol·L-1CDDP处理细胞48h后,检测骨膜蛋白的表达水平。结果显示,随着CDDP浓度的增加,骨膜蛋白的m RNA和蛋白表达水平均呈现增多的趋势。骨膜蛋白的表达水平与CDDP的浓度呈正相关,差异有统计学意义,P?0.01。3耐药细胞株A549/CDDP中骨膜蛋白的m RNA表达水平是亲本细胞株A549的6倍(P?0.05);且A549/CDDP中骨膜蛋白的蛋白表达水平是A549的5.1倍(P?0.05),差异均具有统计学意义。结论:1针对人非小细胞肺癌细胞株A549,通过梯度增加顺铂给药剂量,成功构建了顺铂耐药细胞株A549/CDDP。2通过对A549和A549/CDDP两株细胞耐药性和骨膜蛋白表达的分析,发现骨膜蛋白的表达与非小细胞肺癌顺铂耐药之间呈正相关。第二部分骨膜蛋白对A549细胞部分生物学行为的影响及相关机制目的:分析骨膜蛋白对人非小细胞肺癌细胞株A549的增殖、细胞周期、细胞凋亡等一系列生物学行为的影响;并研究抑制凋亡的重要信号通路Stat3/survivin在其中发挥的作用,进一步探讨其可能涉及的作用机制。方法:1构建骨膜蛋白过表达质粒载体,将过表达载体通过瞬时转染的方式转入A549细胞中,检测其转染效率。2采用MTT、流式细胞术、Western blot方法检测骨膜蛋白过表达对顺铂诱导的A549细胞生存率、细胞周期、细胞凋亡的影响,检测Stat3/survivin信号通路的活性。3采用质粒共转染的方法同时在A549细胞中过表达骨膜蛋白和沉默survivin,研究骨膜蛋白调控顺铂耐药的可能作用机制。结果:1将构建的骨膜蛋白质粒转入A549细胞之后,可显著提高骨膜蛋白的表达。2 MTT结果提示,同对照组相比,10~30μM CDDP刺激下骨膜蛋白过表达组细胞活力分别增加1.56±0.37、1.62±0.17、3.43±1.82倍(P<0.05);说明外源性过表达骨膜蛋白可显著增加A549细胞对顺铂的抵抗力。3流式细胞术DNA含量检测细胞的周期分布。结果显示:对照组、10μMCDDP处理组、CDDP+pc DNA3.1(+)vector处理组G0/G1期细胞数所占百分比分别为:50.04±3.27%,90.30±4.25%,88.2±3.78%,S期细胞所占百分比分别为:46.44±2.31%,8.69±2.79%,8.92±2.81%,转染pc DNA3.1(+)vector对CDDP抑制的周期转换未见明显影响(P>0.05);相对于CDDP处理组,CDDP+POSTN过表达组G0/G1期细胞所占百分比由90.3±4.25%降低到67.49±5.3%,与之对应的S期细胞比例则由8.69±2.79%增加到28.84±2.11%(P<0.05 vs CDDP)。4流式细胞仪Annexin V/PI双染法定量分析A549细胞凋亡情况。结果发现:对照组、10μM CDDP处理组、CDDP+pc DNA3.1(+)vector处理组细胞早期凋亡率分别为:2.45±0.56%,26.32±2.21%,27.93±3.71%,细胞中晚期凋亡/坏死率分别为:2.57±0.46%,13.02±2.01%,12.33±2.35%;相对于CDDP处理组,CDDP+POSTN过表达组细胞早期凋亡率由26.32±2.21%降低到11.91±2.74%,细胞中晚期凋亡/坏死率则由13.02±2.01%降低到7.03±2.05%(P<0.05vs CDDP),外源性过表达骨膜蛋白可显著抑制CDDP诱导的A549细胞凋亡。5 Western Blot检测A549细胞Caspase-3的活化情况,结果显示,10μM CDDP刺激细胞后,A549细胞激活型Caspase-3的表达量明显增加,但是过表达POSTN转染组则可明显逆转CDDP对Caspase-3的活化。6 A549细胞株过表达骨膜蛋白后,检测Stat3/survivin信号通路活性的变化,结果显示:同对照组相比,10μMCDDP处理48h可使A549细胞中Stat3的磷酸化水平降低到0.43±0.05倍,过表达骨膜蛋白之后,CDDP诱导的Stat3的磷酸化水平从0.43±0.05增加到0.87±0.09(P<0.05vs.CDDP);10μM CDDP处理48h后,细胞中survivin的表达减少到0.38±0.03倍,过表达骨膜蛋白后,CDDP诱导的survivin的表达水平从0.38±0.03增加到0.79±0.06(P<0.05vs CDDP)。7在过表达骨膜蛋白的A549细胞中沉默survivin之后,流式细胞术分析结果显示:10μMCDDP处理组,骨膜蛋白过表达组细胞早期凋亡率分别为:26.89±2.24%,13.13±1.54%,细胞中晚期凋亡/坏死率分别为:13.24±2.63%,8.42±2.57%;相对于POSTN过表达组,POSTN+S-sh RNA组细胞早期凋亡率由13.13±1.54%增加到19.97±2.14%(P<0.05 vs POSTN)。除此之外,过表达POSTN可明显抑制A549细胞上CDDP诱导的Caspase-3的活化,但干扰survivin的表达之后,这一抑制作用被逆转(P<0.05 vs CDDP)。结论:成功构建了骨膜蛋白过表达载体,研究表明在A549细胞中外源性过表达骨膜蛋白可通过促进细胞周期转换,促进细胞增殖,同时抑制细胞凋亡,逆转顺铂的促凋亡作用。其作用机制可能是骨膜蛋白激活Stat3/survivin信号通路,进而导致肿瘤细胞产生凋亡抵抗。第三部分沉默骨膜蛋白逆转非小细胞肺癌顺铂耐药的体内外研究目的:利用骨膜蛋白干扰sh RNA构建骨膜蛋白低表达的耐药细胞A549/CDDP,探讨沉默骨膜蛋白是否可以在体外逆转非小细胞肺癌耐药的发生及相关作用机制;通过建立裸鼠非小细胞肺癌异体移植瘤模型,在体内进一步探讨沉默骨膜蛋白的表达对非小细胞肺癌顺铂耐药的影响。方法:1利用骨膜蛋白干扰sh RNA沉默耐药细胞A549/CDDP中骨膜蛋白的表达,通过MTT、流式细胞术、western blot检测技术观察细胞生存率及细胞凋亡等相关生物学行为的改变。2建立裸鼠非小细胞肺癌异体移植瘤模型,观察沉默骨膜蛋白的表达对顺铂抑瘤效率的影响,比较分析肿瘤组织中Stat3/survivin信号通路活性的变化。结果:1采用western blot的方法检测经G418筛选后稳定转染P-sh RNA的A549/CDDP中骨膜蛋白的干扰效率。结果显示:P-sh RNA组骨膜蛋白的表达是对照组的0.42±0.09倍,且位置正确。说明转染P-sh RNA可显著降低内源性骨膜蛋白的表达。2 MTT结果显示:同对照组相比,0~30μMCDDP刺激下P-sh RNA组细胞活力分别为1.0±0.05、0.7±0.04、0.64±0.09倍(P<0.05),说明外源性沉默骨膜蛋白可提高耐药细胞株A549/CDDP对顺铂的敏感性。3流式细胞术检测细胞凋亡情况,结果发现:对照组(A549/CDDP),30μM CDDP处理组,CDDP+C-sh RNA处理组细胞早期凋亡率分别为:2.15±0.41%,13.41±2.43%,15.14±2.54%,细胞中晚期凋亡/坏死率分别为:1.92±0.32%,8.83±2.01%,10.01±2.37%;相对于CDDP处理组,CDDP+P-sh RNA组细胞早期凋亡率由13.41±2.43%增加到29.87±3.21%,细胞中晚期凋亡/坏死率则由8.83±2.01%增加到20.13±3.14%(P<0.05 vs CDDP)。4通过对移植瘤体积的测量发现,用药前各组裸鼠移植瘤平均体积未见统计学差异(P>0.05);给予PBS或CDDP干预20天后,C-sh RNA+PBS组、P-sh RNA+PBS组、C-sh RNA+CDDP组、P-sh RNA+CDDP组移植瘤体积分别为(2900±150.28)、(2100±135.16)、(1630.75±109.60)、(445±41.04)mm3,均大于各组给药前体积(P<0.01),P-sh RNA+CDDP组移植瘤体积最小。5对移植瘤组织中Stat3/survivin信号通路活性的检测发现:同C-sh RNA+PBS组相比,C-sh RNA+CDDP治疗组移植瘤组织中Stat3的磷酸化水平降低到0.63±0.06倍,沉默骨膜蛋白后,P-sh RNA+CDDP治疗组移植瘤组织中Stat3的磷酸化水平则进一步降低至0.32±0.03(P<0.05vs C-sh RNA);同C-sh RNA+PBS组相比,C-sh RNA+CDDP治疗组移植瘤组织中survivin的表达水平降低到0.58±0.07倍,沉默骨膜蛋白后,P-sh RNA+CDDP治疗组移植瘤组织中survivin的表达水平则进一步降低至0.21±0.02(P<0.05vs C-sh RNA)。结论:1沉默骨膜蛋白可显著增加人非小细胞肺癌顺铂耐药细胞A549/CDDP对顺铂的敏感性,促进细胞凋亡。2体内研究同样显示沉默骨膜蛋白可提高顺铂的抑瘤效率,并抑制Stat3的磷酸化及其下游靶基因Survivin蛋白的表达。