宫颈癌(Cervical Cancer)是全球女性第四常见的恶性肿瘤，在女性恶性肿瘤中发病率居第二位，每年528，000例妇女被确诊为宫颈癌，266，000例妇女死于宫颈癌。而发展中国家宫颈癌病例占全球总数的85％。在中国，宫颈癌的发病率为7.5/10万，死亡率为3.4/10万。宫颈癌已成为严重威胁妇女生命健康的恶性肿瘤之一。　　WAPL(wings apart-like)基因是1977年在果蝇体内发现的一个基因，定位于果蝇的X染色体2D5-2D5。在有丝分裂中，WAPL基因编码的蛋白质主要功能是管理异染色质结构，维持姐妹染色单体的黏合。WAPL基因的变异会妨碍姐妹染色单体的正常靠近和并列，但不影响染色单体各自的凝集和分离。　　WAPL基因在人体内的同源序列称为hWAPL(human wings apart-like)基因，长约30，793bp，定位于10q23.2。hWAPL蛋白是一种聚合锚定蛋白，和WAPL蛋白保守区域高度同源。hWAPL蛋白可以在有丝分裂前期使染色体臂的聚合适时解离。但hWAPL基因的过度表达，则会使得姐妹染色单体过早解离。hWAPL基因的高表达会导致细胞染色体断裂，有丝分裂中产生非整倍体或者多核细胞，导致染色体的不稳定性增加，从而扰乱有丝分裂，导致肿瘤发生。　　在对多种癌组织及癌细胞系的研究中发现，hWAPL基因仅在宫颈癌组织及细胞系中高表达，是宫颈癌的特异性高表达基因。在对正常宫颈上皮组织、宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)组织和宫颈癌组织的研究中发现，随着宫颈病变的进展，hWAPL基因的表达逐步增强。hWAPL基因在宫颈癌的发生发展中起重要作用。hWAPL基因具有癌基因特性，hWAPL基因表达产物可能起S期检测点或者其他凋亡路径的作用。在宫颈癌细胞系中抑制了hWAPL基因的表达会导致细胞凋亡，而在动物实验中抑制了hWAPL基因的表达则会明显抑制肿瘤生长。同时hWAPL基因的多态性和宫颈癌易感性密切相关。　　Myc基因是癌基因，c-Myc是其家族的成员之一。人类c-Myc基因定位于染色体8q24区。c-Myc基因编码的蛋白质是一种具有DNA结合功能的核蛋白，在核内信息传递中起重要的作用。c-Myc蛋白在细胞胞浆内合成后，转移至细胞核内，与特异的DNA序列的CACGTG核心序列序列结合，激活或增强靶基因的转录和表达，促进细胞的增殖，同时也参与了肿瘤的发生和发展。　　c-Myc基因的功能包括，抑制细胞分化，促进细胞增殖，调节细胞周期，参与细胞调亡等。其表达产物是细胞周期由G0/G1向S期演进所必需的，它主要是通过影响各种细胞周期素启动细胞周期演进。在生理状况下，c-Myc基因的适度表达维持细胞的正常增殖和凋亡状态，维持细胞内环境稳定。c-Myc原癌基因如果被激活为癌基因，会使细胞脱离正常生长调节的限制并向恶性表型转化，并抑制细胞调亡。　　在正常细胞中，c-Myc的表达受到严密而且精细的调控，呈较低的水平表达。c-Myc基因与宫颈癌的发生发展密切相关。在宫颈癌组织中，c-Myc基因的阳性表达率明显高于正常宫颈组织。c-Myc基因的扩增和过度表达可能是宫颈癌发生中的早发事件。c-Myc基因表达程度随着宫颈病变的恶性程度增高而增强，而且宫颈癌组织及CIN3组织与CIN1组织及CIN2组织相比，c-Myc基因的表达明显增强。c-Myc基因表达程度，随着FIGO分期、病理学分级以及分化程度的升高而升高。c-Myc基因的表达可作为判断宫颈癌预后的一个重要指标。　　作为一个只在宫颈癌组织中特异性高表达的癌基因，hWAPL基因在宫颈癌的早期诊断、基因诊断和生物学治疗方面具有极其重要的意义。但hWAPL基因的调控机制、调控途径及其在宫颈癌中特异性高表达的原因并不清楚。hWAPL基因核心启动子定位、转录因子和信号转导途径等方面，国内外都无相关研究。本课题从hWAPL基因的调控机制入手，首先研究并明确hWAPL基因核心启动子的定位;而后根据hWAPL基因启动子所在区域，利用生物信息学方法对hWAPL基因转录因子进行预测。根据预测结果，选择c-Myc蛋白为研究对象，明确c-Myc蛋白是否具有转录激活活性;最后研究c-Myc蛋白是否能和hWAPL基因核心启动子所在区域结合，是否是hWAPL基因的转录因子。　　实验目的:　　1.研究并明确hWAPL基因核心启动子定位。　　2.研究c-Myc蛋白是否具有转录激活活性;　　3.研究c-Myc蛋白能否和hWAPL基因核心启动子所在区域结合，是否是hWAPL基因的转录因子。　　本实验研究内容共分三个部分:　　第一部分hWAPL基因核心启动子的定位　　目的:　　研究并明确hWAPL基因核心启动子定位。　　方法:　　应用荧光素酶检测实验。　　1)选取hWAPL上游-3000bp为研究对象，利用荧光素酶检测为研究方法进行分析将hWAPL上游-3000bp分成两段，分别是-2617—-1317bp和-1317—-1bp。　　2)分析步骤如下:构建载体，两段目的基因分别与pMD18-T载体的连接、转化并检测;构建融合表达载体pGL4.17，将目的基因插入luc2报告基因前面;去内毒素质粒提取;Lipofectamine3000转染试剂转染细胞后进行荧光素酶活性检测。　　3)经分析，hWAPL基因核心启动子位于hWAPL基因上游-1317—-1bp区域内。　　4)将hWAPL基因上游-1317—-1bp区域分为三段，分别是-900—-1bp，-600—-1bp，-300—-1bp，分别利用荧光素酶检测实验进行分析，步骤同上。结果　　hWAPL基因核心启动子位于hWAPL基因上游-300—-1bp内。　　第二部分hWAPL基因转录因子的生物信息学预测和c-Myc蛋白转录激活活性的研究　　目的:　　对hWAPL基因转录因子进行生物信息学预测，研究c-Myc蛋白是否具有转录激活活性　　方法:　　根据hWAPL基因启动子所在区域，利用生物信息学方法对hWAPL基因的转录因子进行预测。根据FRANSFAC数据库的PWM预测算法、ENCODE数据的预测算法和JASPAR数据的预测算法等三种预测对hWAPL基因转录因子进行预测。选择三种预测结果交集中的c-Myc蛋白研究对象，验证c-Myc蛋白是否为hWAPL基因的转录因子。　　c-Myc蛋白转录激活活性的研究利用酵母双杂交的自激活实验。　　1)载体构建:构建c-Myc-pGBKT7载体;　　2)准备酵母细胞AH109感受态细胞;　　3) pGBKT7载体和pGADT7载体共转化酵母菌株AH109，克隆至SD/-Leu/-Trp，挑取克隆至SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp培养基上培养;　　4) X-gal检测实验，将四缺SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp培养基平皿上的克隆转接到新的含有X-gal的选择性四缺培养基上，观察克隆是否变蓝。　　结果:　　1)在三种预测结果的交集中，c-Myc蛋白是hWAPL基因的转录因子之一。　　2)酵母双杂交结果显示所有共转BD和AD载体的Y187菌株在二缺培养基上都长出了克隆，说明共转化成功。　　3)将SD/-Leu/-Trp培养基上的克隆挑取至SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp培养基平皿中培养发现，除了共转化阴性对照组未长出克隆外，其余实验组别均长出克隆。　　4)将SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp上的克隆挑取至含有x-gal的SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp上培养发现克隆有变蓝，此实验结果说明c-myc蛋白有自激活活性。　　第三部分 c-Myc蛋白和hWAPL基因核心启动子的关系研究　　目的:　　研究c-Myc蛋白能否和hWAPL基因核心启动子所在区域结合，是否是hWAPL基因的转录因子　　方法:　　应用酵母单杂交实验。　　1)构建c-Myc-pGADT7和hWAPL-pHIS2载体;　　2)准备酵母Y187感受态细胞;　　3) pGADT7和pHIS2共转化酵母菌株Y187，克隆至选择性的SD/-Trp-Leu-His并在加有3-amino-1，2，4-triazole(3-AT)的营养缺陷型培养基上培养;　　4)酵母单杂交，将c-Myc-pGADT7和hWAPL-pHIS2质粒共转化酵母菌Y187，观察酵母细胞能否在SD/-Trp-Leu-His并在加有3-amino-1，2，4-triazole(3-AT)的营养缺陷型培养基上生长。　　结果:　　1)酵母双杂交结果显示所有共转pHIS2和AD载体的Y187菌株在二缺培养基上都长出了克隆，说明共转化成功。　　2)将SD/-Leu/-Trp培养基上的克隆挑取至SD/-His/-Leu/-Trp（含20mM的3-A）平皿中培养发现，所有实验组别都正常长出克隆，说明20mM的3-AT不足以抑制实验组的组氨酸表达;　　3)将3-AT含量进一步加大到40mM，将克隆挑取至SD/-His/-Leu/-Trp(含40mM的3-AT)平皿中培养发现，除了阳性对照组可以正常长出克隆外，其余组别均未长出克隆，此实验结果说明c-Myc蛋白和hWAPL基因的核心启动子并不存在结合情况。　　结论:　　1.hWAPL基因核心启动子位于hWAPL基因上游-300—-1bp内。　　2.c-Myc蛋白具有转录激活活性。　　3.c-Myc蛋白不能和hWAPL基因核心启动子所在区域结合;c-Myc蛋白不是hWAPL基因的转录因子。