结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)作为常见的消化道恶性肿瘤之一,严重危害了人类的健康。虽然临床上针对结直肠癌的治疗有了极大进展,但是肿瘤的复发和转移仍然是结直肠癌患者最主要的死亡原因。目前结直肠癌远处转移的分子机制尚不清晰,因此了解结直肠癌远处转移的分子机制是治疗转移性结直肠癌的关键。叉头框蛋白C1(FOXC1)是具有高度保守DNA结合结构域的一类转录因子,可以广泛调控胚胎发育、细胞分化、新陈代谢等生物学过程。此外,FOXC1蛋白也参与了多种人类恶性肿瘤的发病过程,FOXC1异常表达不仅和病人的不良预后密切相关,还能调控多种肿瘤细胞生物学行为,包括促进肿瘤细胞增殖和转移、维持肿瘤细胞干性以及诱导肿瘤细胞耐药等。然而FOXC1促进结直肠癌进展的分子机制研究较少,而且结直肠癌中关于FOXC1蛋白磷酸化修饰的调控机制尚不明确。P38 MAPK信号通路可通过促进胞内蛋白激酶、转录因子等蛋白发生磷酸化修饰,从而广泛调控多种生物学过程。许多胞内重要的转录因子需要经p38 MAPK活化才能发挥其生物学功能。在前期研究中,我们采用显微切割技术发现FOXC1在结直肠癌肿瘤芽细胞和肿瘤细胞中表达高于正常肠上皮细胞。尽管已有研究报道FOXC1具有促进肿瘤的作用,但FOXC1在结直肠癌中表达上调的临床意义、FOXC1促进结直肠癌进展的分子机制以及FOXC1的上游调控信号通路等问题还有待探索。因此本课题以此为切入点检测了结直肠癌组织中FOXC1的表达并分析其与临床病理参数及预后的联系,明确了FOXC1表达上调在结直肠癌中的临床意义;通过细胞学实验确认了FOXC1在结直肠癌细胞中的生物学功能;并采用生物化学和分子生物学方法鉴定了FOXC1在结直肠癌细胞中上下游调控信号通路。(1)FOXC1在结直肠癌中的表达和临床意义我们通过分析公共数据库以及检测114对结直肠癌病人中的FOXC1 m RNA水平,发现FOXC1在病人的肿瘤组织表达显著高于正常组织,而且FOXC1高表达和淋巴结转移、TNM分期相关。临床组织样本和部分公共数据库中FOXC1高表达和病人的不良预后相关,综合了公共数据库和我们临床组织样本结果的系统性分析表明FOXC1高表达是导致死亡的风险因素。在蛋白水平上,我们通过免疫组织化学技术对134例结直肠癌病人组织切片进行染色,发现FOXC1蛋白定位于细胞核与细胞浆,在肿瘤部位表达显著高于正常,并且FOXC1高表达病人预后差。(2)FOXC1促进结直肠癌的转移为了证明FOXC1对结直肠癌细胞转移能力的影响,我们在FOXC1高表达细胞系中敲降FOXC1,通过transwell侵袭迁移实验发现FOXC1沉默抑制肿瘤细胞的侵袭和迁移能力。相反,在FOXC1低表达细胞系中过表达FOXC1可促进细胞的侵袭和迁移能力。为了进一步探索体内FOXC1对结直肠癌的促转移作用,我们分别构建免疫缺陷小鼠(Nod-scid)尾静脉-肺转移模型和裸鼠(BALB/c nu/nu)脾脏-肝转移模型,两种动物模型结果进一步验证了FOXC1具有促进结直肠癌转移的作用。(3)FOXC1通过转录激活EMT相关基因MMP10、SOX4和SOX13等促进结直肠癌转移为了进一步探索FOXC1促进肿瘤转移的分子机制,我们通过CRISPR/Cas9技术构建了稳定敲除FOXC1的HCT8单克隆细胞并进行转录组测序,生物信息学分析发现FOXC1敲除后下调的差异表达基因富集于细胞迁移等生物学过程。同时我们利用q PCR和western blot对部分EMT相关基因进行验证,发现FOXC1可调控MMP10,SOX4,SOX13等下游靶基因表达。进一步的,我们通过荧光素酶报告基因、CHIP-PCR等实验证实MMP10为FOXC1的直接作用靶基因。进而我们在FOXC1敲除细胞中过表达MMP10,发现MMP10可恢复肿瘤细胞的侵袭和迁移能力。而在FOXC1过表达的细胞中敲降MMP10,则抑制了FOXC1过表达增强的侵袭和迁移能力。此外,我们也通过尾静脉-肺转移模型和脾脏-肝转移模型体内实验证实了FOXC1通过调控MMP10表达促进结直肠癌转移。(4)P38通过磷酸化修饰FOXC1阻断其泛素化降解我们通过对FOXC1蛋白序列进行分析,发现FOXC1蛋白的磷酸化结构域内有若干潜在的磷酸化修饰位点,因此选择了8种常见的激酶抑制剂处理HCT116结直肠癌细胞并发现p38 MAPK特异性抑制剂SB203580可降低FOXC1蛋白水平而不影响FOXC1 m RNA水平。通过稳定性实验,发现p38可提高FOXC1蛋白质稳定性,并阻断FOXC1经蛋白酶体途径的降解。进一步通过免疫共沉淀实验证实p38可以与FOXC1相互结合,从而激活FOXC1磷酸化结构域的241和272位丝氨酸残基,这两个位点的磷酸化修饰抑制了FOXC1的泛素化并维持蛋白稳定性。进一步通过冈田酸(Okadaic acid,OA)处理抑制FOXC1去磷酸化验证了FOXC1的磷酸化导致其泛素化水平降低,进而提高FOXC1蛋白稳定性,从而使FOXC1蛋白在细胞内积累。为了研究p38所介导的FOXC1蛋白稳定性对结直肠癌细胞生物学功能的影响,我们通过transwell实验证实过表达p38可以促进结直肠癌细胞的侵袭和迁移能力,而p38缺陷时,通过OA处理细胞阻断FOXC1蛋白降解也可以恢复细胞的迁移和侵袭能力。最后,我们利用q PCR和western blot实验证实p38可以调控FOXC1下游靶基因MMP10,SOX4和SOX13的表达。对67例结直肠癌临床样本进行免疫组织化学染色并进行免疫评分,我们发现p38与FOXC1、MMP10蛋白水平表达呈正相关,且高表达p38,MMP10病人的预后越差。基于上述实验结果,我们得出了以下结论:(1)FOXC1在结直肠癌中异常表达和肿瘤病人淋巴结转移、TNM分期密切相关,且FOXC1表达越高,病人预后越差,FOXC1有望成为一个新的结直肠癌预后标志物。且FOXC1具有促进结直肠癌细胞转移的生物学作用。(2)FOXC1转录激活MMP10,SOX4,SOX13等下游靶基因,诱导结直肠癌细胞发生EMT促进肿瘤转移。此外,FOXC1直接结合到MMP10的启动子区域,通过调控MMP10表达从而发挥促进结直肠癌转移的生物学功能。(3)P38通过与FOXC1相互作用并磷酸化FOXC1的Ser241和Ser272位点,活化的Ser241和Ser272是维持FOXC1蛋白稳定性的关键位点,可抑制FOXC1经泛素化降解,提高胞内FOXC1表达。P38导致FOXC1蛋白稳定性增强,进而上调FOXC1下游靶基因MMP10等表达,促进结直肠癌的转移。