论文部分内容阅读
目的研究表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(EGFR vⅢ)胞外段修饰树突状细胞诱导CTL细胞对EGFR vⅢ阳性的胃癌7901细胞的杀伤作用,初步探讨其作用机制。方法构建表达EGFR vⅢ的慢病毒,应用荧光定量法测定其滴度,采用密度梯度离心法从人外周血中分离T淋巴细胞和单核细胞,利用细胞因子rh IL-4(100ng/ml),rh GM-CSF(100ng/ml)及rh TNF-a(50ng/ml)诱导单核细胞向树突状细胞(DC)分化,通过流式细胞仪检测树突状细胞表面抗原CD80,CD83,HLA-DR验证DC的成熟,用含有EGFR vⅢ的慢病毒转染DC,应用Western-blot测定EGFRvⅢ在DC的表达,用ELISA法,检测上清中的IL-10和IFN-γ分泌量。空白DC,EGFRvⅢ慢病毒感染的树突状细胞、阴性对照的树突状细胞与T淋巴细胞按照1:5,1:10,1:20,1:40共培养,72h后加入CCK-8,放入37℃的二氧化碳的培养箱培养4小时,之后显微镜下观察,然后用酶标仪检测加入CCK-8后,在波长为450nm的情况下每组混合细胞培养后的上清液的的吸收值,将从成人外周血中培养的T淋巴细胞分别与空白DC,EGFRvⅢ慢病毒感染的树突状细胞、阴性对照的树突状细胞在37℃共培养(刺激细胞/效应细胞=1:20)收集细胞培养的上清,取传代后的SGC7901细胞和SGC7901-vⅢ做为靶细胞,按不同比例的效应细胞和靶细胞的比例(1:5,1:10,1:20,1:40)加入不同组的T细胞,继续培养24小时,MTT法测定杀伤情况。以上所有实验均重复3次。结果1、利用密度梯度离心法和细胞因子诱导法成功培养出了成熟的树突状细胞和T淋巴细胞。2、未加入TNF-a的树突状细胞CD80,CD83,HLA-DR表达率为:35.5%,25.1%,33.2%,加入TNF-a的CD80,H’LA-DR表达率为:82.7%,69.6%,感染EGFR vⅢ的树突状细胞CD-80,HLA-DR-APC表达率为:86.3%,76.0%。3、慢病毒携带目的基因EGFRvⅢ感染树突状细胞,Western Blot检测EGFRvⅢ蛋白结果显示感染过的DC对EGFR vⅢ的表达率为58%。4、显微镜下观察携带目的基因EGFR vⅢ的慢病毒感染树突状细胞可获得较高的感染率,达60%。5、感染EGFR vⅢ的DC与自身T淋巴细胞混合培养,可刺激T淋巴细胞产生更多的具有抗肿瘤活性的细胞因子IL-10及INF-r,且呈剂量依赖性。6、同等条件下EGFRvⅢ胞外段修饰树突状细胞诱导CTL细胞对EGFRvⅢ阳性胃癌7901细胞的杀伤作用更强。结论1、从人外周血通过密度梯度离心及细胞因子刺激法可获取高纯度的T淋巴细胞及树突状细胞,TNF-a是促进树突状细胞成熟的关键。2、树突状细胞刺激T淋巴细胞产生具有杀伤活性的细胞因子IL-10及INF-r,可杀伤胃癌7901细胞。3、研究表明在体外EGFRvⅢ阳性树突状细胞显著加强了CTL细胞针对EGFRvⅢ阳性的胃癌7901细胞的免疫杀伤作用。