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猪德尔塔冠状病毒（Porcine deltacoronavirus,PDCoV）是一种新型的猪肠道冠状病毒,可感染不同日龄猪,但新生仔猪更易感,感染后主要表现出严重腹泻、呕吐、脱水等临床症状。2012年,在中国香港首次报道了PDCoV。然而,PDCoV疫情的爆发却发生在2014年美国俄亥俄州。随后,在美国养猪州迅速蔓延和传播,造成新生仔猪3040%的死亡率。近年来,PDCoV已在多个国家猪场中流行,包括中国、加拿大、日本、韩国、泰国、墨西哥等国家。当前,由于尚不清楚PDCoV传播和致病机制,并且缺乏有效的疫苗和防控措施,给多个国家造成了巨大的经济损失,对养猪业仍然是一个严峻的挑战。基于此,本研究对PDCoV开展以下几方面的研究,以期为提高PDCoV快速诊断、阐明致病机制和疫苗的研发等奠定基础。1.PDCoV LFD-RPA快速检测方法的建立参照GenBank中已公布的PDCoV N基因保守序列（GenBank登入号:KJ481931）设计特异性引物和探针,建立重组酶聚合酶扩增结合侧流层析试纸条（Recombinase polymerase amplification combined with a lateral flow dipstick,LFD-RPA）检测PDCoV的方法。结果表明,LFD-RPA检测方法具有较广的检测温度（1037℃）,当温度为37℃时可以在20 min内完成PDCoV检测。经验证,该方法最低检测限度为1×102 copies/μL,并且能特异性检测出PDCoV,具有良好的灵敏性和特异性。批间和批内重复性检测结果证实LFD-RPA具有良好的重复性。通过对68份猪腹泻样品（48份直肠拭子样品和20份肠道内容物样品）检测以评价LFD-RPA检测方法的有效性。结果显示,LFD-RPA和RT-PCR检测PDCoV阳性率分别为26.47%（18/68）和23.53%（16/68）,表明LFD-RPA检测方法有效、准确。2.PDCoV毒株的分离、鉴定及生物学特性研究应用猪肾上皮（LLC porcine kidney,LLC-PK）细胞成功从新疆维吾尔自治区采集的猪腹泻样品中分离出一株PDCoV细胞适应株CH/XJYN/2016（GenBank登入号:MN064712）。该毒株在LLC-PK细胞中盲传至P5代时开始出现典型的细胞病变（Cytopathic effect,CPE）。目前,CH/XJYN/2016毒株已稳定传代至P140代,病毒毒价可高达107.8.8 TCID50/mL。经免疫荧光检测出PDCoV抗原呈绿色荧光。应用透射电子显微镜观察到CH/XJYN/2016毒株病毒粒子呈椭圆形,具有典型的“皇冠”状纤突结构。采用RT-PCR扩增获得CH/XJYN/2016毒株的全基因组序列,全长为25 833 nt。序列分析表明,CH/XJYN/2016毒株与其它PDCoV分离株S基因核苷酸同源性为97.7098.74%,其中遗传距离最接近于中国香港株HKU15-44（GenBank登入号:JQ065042）,具有98.74%核苷酸同源性。与其它报道的PDCoV相比,在CH/XJYN/2016毒株S基因中观察到37个核苷酸替换和3个核苷酸插入。S基因系统进化树分析显示,CH/XJYN/2016毒株与从中国、美国、日本和韩国分离的PDCoV毒株亲缘关系较近,而与泰国、越南和老挝分离的PDCoV毒株亲缘关系较远,表明中国、美国、日本和韩国分离的PDCoV毒株可能都来源于共同的祖先。3.PDCoV对不同日龄仔猪的致病性分析及免疫应答的初步评价应用PDCoV CH/XJYN/2016毒株P6代病毒培养物(104 TCID50/mL)口服接种4日龄哺乳仔猪,感染后12 d（days post-infection,dpi）仔猪出现腹泻、呕吐、精神沉郁等临床症状。感染仔猪解剖后发现肠道受损严重,尤其是小肠,出现肠系膜充血、肠壁变薄、充满黄色液体。组织病理学结果显示,小肠绒毛萎缩、融合和脱落。此外,免疫组化结果证实,PDCoV抗原主要存在于小肠绒毛肠细胞中。上述结果表明,CH/XJYN/2016毒株对哺乳仔猪具有较强的致病性。通过PDCoV CH/XJYN/2016毒株P6代病毒培养物口服接种45日龄断奶仔猪,G1G4感染组(104101 TCID50/mL)在314 dpi内相继出现明显的腹泻和病毒脱落,感染组猪血清PDCoV特异性IgG、IgA和病毒中和（virus-neutralization,VN）抗体水平显著升高（P<0.05）。但在21 dpi时所有仔猪均恢复正常,并再次对仔猪口服接种CH/XJYN/2016毒株P6代病毒培养物。再次接种后14 dpi仔猪均无临床症状和病毒脱落,感染组猪血清和唾液中PDCoV特异性IgG、IgA和VN抗体水平却持续增高,并且二者表现出良好的相关性。值得注意的是,首次接种7 dpi时猪血清中IFN-γ抗体水平显著升高,而后却持续下降。测定出断奶仔猪PDCoV半数仔猪腹泻量(The median pig diarrhea dose,PDD50)为2.0 log10PDD50/3mL。此外,应用铝佐剂和206佐剂开发了一种基于CH/XJYN/2016毒株的灭活疫苗并接种免疫仔猪,发现与未接种疫苗的仔猪相比,仔猪接种灭活疫苗后产生了较强的体液免疫应答,攻毒后无临床症状和病毒脱落,表明该疫苗对PDCoV感染猪具有较强的保护作用。4.PDCoV感染LLC-PK细胞的蛋白质组学分析应用LC-MS/MS技术结合串联质谱标签（Tandem mass tag,TMT）,开展了PDCoV感染后18 h和未感染LLC-PK细胞蛋白质组学研究。共鉴定出275个差异表达蛋白（differentially expressed proteins,DEPs）,其中128个显著上调,147个显著下调。生物信息学分析表明,DEPs主要参与防御反应、细胞凋亡和免疫系统。在DEPs生物信息学分析的基础上,表明PDCoV感染可能利用宿主细胞凋亡途径来实现病毒最大化增殖。同时,宿主细胞可能利用JAK/STAT信号通路激活干扰素刺激因子（interferon-stimulated genes,ISGs）转录来抵抗病毒入侵。此外,应用平行反应监测（Parallel reaction monitoring,PRM）技术对候选蛋白进行定量验证。结果表明,PRM定量结果与TMT定量数据相符,进一步证实了蛋白质组学数据的有效性和准确性。