细菌性脑膜炎亦称为化脓性脑膜炎,是各种化脓细菌感染引起的脑膜及脑实质炎症,虽然诊治上有了很大的进展,但死亡率与病死率仍居高不下。颅脑外伤、开颅手术使颅脑开放细菌易于入侵；抗菌药物广泛使用使致病菌耐药性增加；抗肿瘤药物、糖皮质激素等药物的使用使机体免疫下降。上述因素均可导致颅内感染发生率增加。中枢神经系统位于颅骨与椎体的包围之中,与血液系统之间存在血脑屏障(Blood Brain Barrier BBB),大多数经静脉注射的抗生素无法在脑脊液(Cerebro-Spinal Fluid, CSF)内形成有效的杀菌浓度,尽管脑膜炎症可增加血脑屏障的通透性,但对提高CSF中的药物浓度作用有限。静脉给药时增加药物剂量可提高CSF中药物浓度,但也增加了药物全身副作用的发生率。静脉使用万古霉素的主要副作用有红人综合征、肾毒性等。万古霉素是临床治疗化脓性脑膜炎的一线药物,属于糖肽类抗生素,对革兰阳性菌具有强烈的杀灭作用,临床上常用于治疗耐甲氧西林葡萄球菌(methicilin resistant staphylococcus, MRSA)所致各种严重感染。万古霉素为时间依赖性抗生素,杀菌作用与其作用时间相关,提高T>MIC的药代动力学参数对控制感染极为重要,研究表明高剂量万古霉素有利于MRSA的持续清除,也有助于防止细菌对万古霉素的耐药。万古霉素血脑屏障透过率较低,正常时CSF中药物浓度仅为血药浓度18%；在脑膜发生炎症时,CSF中的药物浓度也只有血药浓度的28.6%-48%。为了提高药物在中枢神经系统的浓度,临床可采用经腰椎穿刺鞘内注射抗生素。抗生素鞘内注射治疗颅内感染已治愈大量病例,取得了良好疗效,但仍有部分病例疗效不满意或出现不良反应,在学术界仍有争议。鞘内给药优点在于可配合腰穿同时进行,由于药物不经血脑屏障直接进入蛛网膜下腔,可以有效提高CSF中药物浓度,又避免了大剂量静脉用药带来的副反应。国内外已有大量文献对比研究了静脉给药和静脉给药联合鞘内给药治疗化脓性脑膜炎的疗效、不良反应的发生率、住院时间、治疗费用等方面的优劣,发现静脉给药联合鞘内给药方式治疗效果优于单纯静脉给药,向进等人采用鞘内注射万古霉素,剂量从20mg、40mg、60mg、80mg、100mg、120mg和140mg剂量每日递增,共治疗了31位患者,结果全部达到了治愈标准。但多数患者需要反复多次腰椎穿刺给药才能取得一定效果,多次穿刺给患者带来痛苦,而且有发生硬膜外血肿、刺激马尾神经根、造成二次感染等并发症。腰大池置管技术日臻成熟,已经广泛应用于蛛网膜下腔出血及颅内感染持续引流,并取得了良好效果。我们课题组在国内外首创了椎管内持续给药并已初步应用于临床。我们为1名静脉使用头孢他啶无效且不耐受鞘内注射的化脓性脑膜炎患者行腰大池置管后椎管内持续注射头孢他啶(0.2g/24h),3天后患者症状明显改善,最终达到治愈标准。我们还采用两性霉素B椎管内持续给药治愈了1位难治性新型隐球菌性脑膜炎患者。我们认为椎管内持续给药具有以下优点：①减少经静脉用药量,降低副作用发生率；②药物直接进入蛛网膜下腔,可有效提高CSF中的药物浓度；③椎管内持续给药可使CSF中的药物浓度更为稳定,避免出现过高的峰值浓度,减轻药物的神经系统毒性作用；④椎管内持续给药可减少反复腰穿导致的硬膜外血肿、脑脊液漏、神经根损害等并发症。我们已经对两性霉素B椎管内持续给药进行了人体和动物的药代动力学研究。但万古霉素椎管内持续给药的药代动力学特征、安全性和有效性尚不明确。为了探讨万古霉素椎管内持续给药的药代动力学特征、安全性和有效性,我们建立了新西兰兔腰大池置管给药和小脑延髓池置管CSF取样动物模型,对照研究万古霉素鞘内注射给药和椎管内持续给药的药代动力学特点,为临床万古霉素椎管内持续给药进行前期研究。第一部分小脑延髓池置管动物模型的构建目的研究一种操作简单、手术成功率高、可长期重复留取清醒状态下新西兰兔CSF的小脑延髓池置管技术,以便有效地采集CSF进行药代动力学研究。方法1.实验动物及分组：新西兰兔16只,随机分为A、B两组(8只/组),A组动物经枕骨下缘开取骨窗,将特制的“L”形PE管经骨窗置入小脑延髓池；B组动物于枕骨隆突前开取骨窗,将PE管经枕骨与硬脑膜潜在间隙置入小脑延髓池。2.CSF留取及细胞计数：两组实验动物置管后用250ul微量进样器经留置管抽取CSF,可成功抽取CSF者记为置管成功,无法抽取CSF者记为置管失败。置管成功者分别于术后0h、12h、24h、48h抽取CSF光镜下脑脊液细胞总数计数。3.改良Tarlov’s评分：分别于术后6h、12h、24h、48h采用改良的Tarlov’s单盲法对造模动物进行运动功能评分。4.病理学观察：造模成功的动物术后第14天灌注固定,留取小脑、脑桥、延髓标本进行大体观察留置管位置,行石蜡切片、HE染色观察置管对周围神经组织的损害情况。5.统计分析：计量资料采用t检验,计数资料采用χ检验。结果1.手术耗时及成功率：A组手术时间为44.88±3.48min,置管成功率为100%;B组手术时间为43.60±3.51min (与A组比较,p>0.05),3只术中死亡,置管成功率为62.5%(与A组比较,p>0.05)。两组手术成功动物留置管均保持14天通畅。2.CSF细胞数：A组脑脊液中细胞数目随时间变化逐渐减少,术后第48h基本位于正常水平；B组细胞数随时间无明显变化。3.改良Tarlov’s评分：A组1只动物术后6小时出现左侧肢体行走时稍拖曳,24小时后恢复正常；B组手术成功5只,2只评分满分,3只不同程度的偏瘫或后肢肢体瘫痪A、B两组不同时刻运动功能评分,术后第6h、12h、24h有显著性差异,术后第48h评分无差异。4.病理学观察：A组中有2只动物的小脑下部可见置管所致的少量组织缺损,缺损处见胶质细胞增生,延髓形态学正常；B组中有6只动物置管从小脑中部突破硬脑膜及蛛网膜,穿过小脑中部从脑桥旁进入脑干腹侧,置管穿行处神经组织缺失,局部胶质细胞增生,纤维断裂,2只小脑、延髓形态结构清晰无病理改变。结论经枕骨下缘开骨窗置入“L”形PE管留取CSF的方法操作简单、成功率高、对动物损伤小、能在清醒动物中长时间重复留取CSF,特别适用于CSF药代动力学研究。第二部分腰大池置管动物模型的构建目的研究一种操作简单、手术成功率高、组织损伤小的新西兰兔腰大池置管方法,用于进行椎管内持续给药。方法1.实验动物及分组：新西兰兔16只,随机分为A(经第3荐椎入路组)、B(经腰7/荐1入路组)2组,每组8只。2.手术方法：A组动物采用剪除第3荐椎棘突并于棘突根部开取骨窗,“L”形引导针头穿刺骨窗处脊膜引导PE管进入蛛网膜下腔；B组动物切开腰7/荐1椎间隙一侧的骶棘肌,利用穿刺针穿刺黄韧带并引导PE管进入蛛网膜下腔。3.Tarlov’s评分：分别于术后6h、24h、48h采用改良的Tarlov’s评分方法对动物运动功能进行评价。4.病理学观察：各组动物于术后第14天灌注固定,剥离脊髓观察PE管位置,石蜡切片、HE染色观察。5.统计分析：运动功能评分采用t检验。结果1.手术耗时及成功率：A组手术时间为39±5min,手术成功率为100%；B组手术时间为30+3min(p>0.05),手术成功率为100%。2.Tarlov’s评分：A组术后1只6h动物左下肢运动欠灵活,第24h恢复正常；B组有3只兔术后6h出现一侧下肢运动欠灵活,48h后恢复正常。两组运动功能评分,第6h、24h、48小时评分无显著差异。3.病理学观察：A组中有2只留置管末端位于脊髓背侧,6只留置管末端位于偏于一侧,HE染色可见留置管周围脊髓轻度受压,局部蛛网膜增生。B组中所有留置管均位于脊髓腹侧,3只末端位于蛛网膜下腔,5只位于脊髓内。HE染色：脊髓内置管周围可见留胶质细胞增生、机化、神经元稀疏,留置管附近脊髓受压变形较严重。结论经第3荐椎入路蛛网膜下腔置管方法置管成功率高、操作简单、留置管位于脊髓背侧蛛网膜下腔内,对脊髓仅有轻度压迫,不影响动物运动功能,是一种良好的蛛网膜下腔置管动物模型。第三部分万古霉素椎管内持续给药和鞘内注射的药代动力学研究目的探讨万古霉素椎管内持续给药及鞘内注射给药的药代动力学特点,对万古霉素椎管内持续给药进行初步安全性评价。方法1.实验动物及分组：新西兰兔36只,分为持续给药组(A)与鞘内注射组(B)。每组分为低、中、高三个剂量亚组,分别编号为A1、A2、A3,及B1、B2、B3组,每个亚组各6只。2.手术方法：动物均进行经第3荐椎入路腰大池置管进行万古霉素椎管内持续给药,同时进行经枕骨下缘小脑延髓池置管留取CSF。3.给药及留取CSF方法：A组低、中、高剂量组经腰大池留置管72h内分别持续泵入万古霉素3mg/1500ul、15mg/1500ul、30mg/1500ul; B组低、中、高剂量组15min内经腰大池留置管分别泵入万古霉素0.5mg/125ul、lmg/125、5mg/125ul。以给药开始计时,A组于0h、4h、6h、8h、12h、18h、24h、32h、40h、48h、56h、64h、72h经小脑延髓池置管每次留取50u1CSF,B组在第Oh、0.25h、0.5h、1h、2h、4h、6h、8h、12h、18h、24h、32h、40h、48h、56h、64h、72h经小脑延髓池置管每次留取50u1CSF。4.改良Tarlov’s评分：采用改良的Tarlov’s单盲法对造模动物进行运动功能评分,初步评价两种给药方式的安全性。5.万古霉素浓度检测：运用高效液相色谱测定兔CSF中万古霉素的含量,高效液相色谱条件为GL Inertsil ODS-3系列C18柱(4.6x250mm5um)；流动相组成为甲醇—0.05mol/L pH=3.2磷酸二氢钾缓冲液(21：79),流速为lml/min,检测波长236nm,柱温35℃。进样量l0u1。6.统计学分析：采用t检验对比分析持续给药组及鞘内注射组各亚组药物曲线下面积、改良Tarlov’s评分。结果1.万古霉素CSF浓度与峰面积在0.309mg/L-316mg/L范围内线性关系良好。其回归方程为：Y=0.0001111211263074X+0.1870697973544,n=5,r=0.9993。低、中、高浓度的绝对回收率分别为72.3%、93.6%、85.7%,相对回收率分别为98.5%、99.3%、101.2%,日内精密度分别为4.5%、4.3%、4.9%,日间精密度分别为6.8%、5.7%、5.1%；24小时内短期稳定性良好；保存于-80℃时长期稳定性在6月内良好,第12月降解约30%；冻融稳定性良好。2.A组低、中、高剂量组万古霉素在新西兰兔CSF的药物浓度-时间曲线下面积(AUC～∞)分别为464.021、2097.143、4922.024,B组低、中、高剂量组万古霉素在新西兰兔CSF的药物浓度-时间曲线下面积(AUC～∞)分别为55.238、517.755、3537.366。持续给药组药物浓度曲线平稳处于较高水平。3.改良Tarlov’s评分：注射药物过程中,药物对神经组织具有刺激作用,引起动物不同程度的躁动和后肢肌肉抽动,与药物浓度相关,注射浓度越高,动物反应越明显。持续给药各组及鞘内注射低、中剂量组未出现或出现轻微可逆肢体运动功能障碍,B3组给药后第6h、12h、24h运动功能评分与其他组同时刻比较有统计学意义。结论1.所用高效液相色谱方法测定兔CSF中万古霉素方法简单、方便、快速,专一性好。2.持续给药较鞘内注射在CSF中的药物浓度更平稳,T>MIC时间更长,安全性更高。3.经鞘内注射的药物可在脊髓局部吸收,CSF循环对经蛛网膜下腔注射药物的分布作用小于药物自身扩散,为保证靠近头端CSF中药物浓度,蛛网膜下腔给药应确保足够的药物剂量。4.蛛网膜下腔注射万古霉素,副作用主要为神经根刺激作用以及双下肢瘫痪,与给药剂量与给药浓度相关。