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研究背景和目的各种慢性肝病可经肝纤维化发展为肝硬化,门静脉高压是肝硬化的严重并发症。肝硬化状态下,肝内血管阻力的增加是导致门静脉高压的重要因素。肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)在肝纤维化的发生发展以及门脉高压形成等一系列过程中起至关重要的作用。肝损伤时HSC被激活转化成肌成纤维样细胞表型,并获得收缩性。收缩的HSC一方面可致肝窦直径缩小,肝内血管阻力增大；另一方面引起肝组织瘢痕挛缩,进一步增加肝内血管阻力,导致门静脉高压。因此HSC的收缩调控是研究门脉高压机制的重要因素。目前研究证实,HSC的收缩主要通过非钙途径进行,而在非钙途径中RhoA/ROCK信号通路是近年研究的热点。Rho族蛋白主要通过调节肌动蛋白和细胞骨架的重组,从而调节细胞的收缩和运动。而RhoA/ROCK通路对NO/PKG通路有负性调节作用。激活的RhoA/ROCK通过抑制eNOS的活性而促进HSC收缩,从而增加肝内血管阻力,促进肝硬化门静脉高压的形成。肝内肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)是肝纤维化研究领域的热点。肝脏等局部组织器官具有RAAS,肝内ACE-AngⅡ-AT1R轴的上调可诱导HSC的活化,加重肝损伤,促进肝纤维化形成及门脉高压。ACE2-Ang-(1-7)-Mas受体轴是新发现的RAAS组分,对ACE-AngII-AT-1受体轴有显著抑制作用。同时对心、肺、肾、肝的损伤及纤维化具有保护作用。Ang-(1-7)在体内外能与AT1R竞争性结合,拮抗Ang Ⅱ的活性。另外Ang-(1-7)与Mas受体结合后,可促进NO合成引起血管舒张。因此,本研究的目的旨在①通过体外试验,观察ACE2-Ang(1-7)-Mas受体轴通过调节RhoA/ROCK、NO/PKG信号通路上各元件的表达对AngⅡ诱导的HSC收缩的影响；②通过体内试验,观察Ang-(1-7)对肝纤维化引起的肝星状细胞收缩的影响,及参与门脉高压调控的分子机制。方法1.ACE2-Ang-(1-7)-Mas受体轴对大鼠肝星状细胞系收缩的影响采用HSC-T6细胞株,电子显微镜下观察细胞形态的变化；Ⅰ型鼠尾胶原法(Type I rat-tail collagen)观察HSC-T6的收缩；激光共聚焦显微镜下观察TRITC-鬼笔环肽(TRITC-phalloidin)标记肌动蛋白(F-actin)显示微丝骨架在细胞中的分布和动态变化。2. ACE2-Ang-(1-7)-Mas受体轴抑制Angll诱导肝星状细胞收缩机制的体外研究采用HSC-T6细胞株,分别给予AT1R阻断剂(10nMIrbesartan)、Mas受体阻滞剂(10nMA779)、ROCK-2抑制剂(10nM Y27632)预处理1h, AngⅡ(1nM)与Ang-(1-7)(1nM)、AngⅡ (1nM)+Ang-(1-7)(1nM)与A779(10nM)、AngⅡ(1M)与Y27632(10nm)AngⅡ(1nM)与Irb(10nM)共处理15min后,Pull-down GST法提取不同组别RhoA GTP活性蛋白,免疫印记法检测RhoA GTP蛋白表达水平；分别提取不同组别细胞膜蛋白,免疫印迹法检测Ras、RhoA蛋白表达水平；提取不同组别细胞总蛋白,免疫印迹法检测RhoA/ROCK通路上Phosphorylation of moesin(P-moesin)和moesin、P-MLC和MLC蛋白表达水平；NO/PKG通路上P-VASP和VASP、P-eNOS和eNOS蛋白表达水平；提取不同组别细胞内RNA,逆转录为cDNA,荧光定量聚合酶链反应(Quantitative Real-time PCR, Q-PCR)检测促纤维化基因CTGF的表达。构建ACE2siRNA和lenti-ACE2慢病毒载体转染细胞,免疫印记法检测RhoA/ROCK通路及NO/PKG通路上各蛋白水平。3.Ang-(1-7)抑制肝星状细胞收缩对门脉高压调控机制的体内研究构建假手术组大鼠模型(sham)、胆管结扎肝纤维化组大鼠模型(BDL)及BDL基础上Ang-(1-7)治疗组模型(BDL+Ang-(1-7)),通过对肝组织HE染色及Masson染色进行ISHAK及METAVIR肝纤维化评分；羟脯氨酸含量测定；免疫组化法及免疫印迹法检测RhoA/ROCK通路及NO/PKG通路上各蛋白表达；Q-PCR法检测RhoA/ROCK通路上Rho GEFs (Rho Guanine Nucleotide Exchange Factors, Rho GEFs)、RhoA GTP及ROCK-2(Rho kinase) mRNA的表达以及NO/PKG通路上eNOs mRNA的水平。彩色多普勒血流超声检测(CDFI)检测肝门静脉血流速度及肝门静脉内径；原位肝灌注法检测肝外门静脉压力及肝内血管阻力。结果1. ACE2-Ang(1-7)-Mas受体轴抑制AngⅡ诱导的HSC-T6细胞收缩在电子扫描显微镜下可见Ang-(1-7)及Irb能够抑制细胞伸展和体积增大；激光共聚焦显微镜观察可见经FITC-phalloidine染色的细胞骨架中的微丝(F-actin), Ang-(1-7)、Irb及Y27632能够显著抑制AngⅡ诱导的F-actin数量增多；Ⅰ型鼠尾胶原法可观察到AngⅡ可诱导HSC-T6细胞收缩,而Ang-(1-7)、Irb及Y27632能够抑制AngⅡ诱导HSC-T6细胞收缩的效应。2.ACE2-Ang-(1-7)-Mas受体轴抑制AngⅡ诱导HSC-T6收缩机制的体外研究在蛋白水平,ACE2-Ang-(1-7)-Mas受体轴能够显著抑制AngⅡ诱导的RhoAGTP活性蛋白(P=0.001)、moesin蛋白磷酸化(P=0.000)、MLC蛋白磷酸化(P=0.000)及α-SMA增高水平,而Y27632(RhoA激酶抑制剂)也能够显著降低RhoA GTP活性蛋白(P=0.000)、moesin蛋白磷酸化(P=0.000)水平；在基因表达水平,ngⅡ处理组CTGF mRNA(P=0.000)的表达显著增强,Ang-(1-7)处理组表达显著减弱(均P<0.01)。AngⅡ+Ang-(1-7)、AngⅡ+Irb、AngⅡ+Y27632联合处理组均能够显著减低上述元件的表达水平(均P<0.001)。同时,本研究成功构建ACE2siRNA和lenti-ACE2慢病毒载体。结果显示：lenti-ACE2感染HSC-T6后,RhoA及其下游ROCK活性被显著抑制。NO及其下游PKG活性显著增强。ACE2siRNA转染HSC-T6后,作用则相反。3.Ang(1-7)抑制肝星状细胞收缩对门脉高压调控机制的体内研究通过对Sham组、BDL组及BDL+Ang-(1-7)组大鼠肝组织HE染色及Masson染色进行ISHAK及METAVIR肝纤维化评分发现,BDL组肝纤维化评分显著高于Sham组(P=0.000),而BDL+Ang-(1-7)组能够显著降低BDL组肝纤维化评分(P=0.000),但两者均较Sham组高；不同组别大鼠肝组织中羟脯氨酸(Hyp)及I型胶原含量显示,BDL组显著高于Sham组(P=0.000),而BDL+Ang-(1-7)组显著低于BDL组(P=0.000)。免疫组织化学法检测蛋白表达发现,BDL组肝脏P-moesin和a-SMA表达水平明显增加,Ang-(1-7)治疗组大鼠肝脏中P-moesin和a-SMA染色较胆管结扎组减弱,包括阳性细胞数目及染色信号强度均减弱；在蛋白水平,BDL组大鼠肝组织内RhoA/ROCK通路上RhcA、Ras、P-moesin及a-SMA蛋白表达水平均显著升高(均P<0.01), Ang-(1-7)治疗组P-moesin及a-SMA蛋白水平下降,均具有统计学意义(均P<0.01),而Ras及RhoA水平与BDL组无明显差异；在NO/PKG通路上,Ang-(1-7)治疗组P-eNOS与P-VASP表达明显增高(均P=0.000)。在基因水平,BDL组大鼠肝组织内RhoA/ROCK通路上Rho GEF、RhoA、ROCK-2mRNA的表达均显著升高(均P=0.000)；在NO/PKG通路中Ang-(1-7)治疗组eNOS mRNA表达亦明显增高(P=0.000)。血流动力学指标变化在于：CDFI检测可见BDL组较Sham组大鼠肝脏表面明显不平、呈锯齿状或波浪状,肝脏内部回声多表现增强,光点增粗,分布均匀或不均匀,有时见网状较强回声的分隔。肝静脉可受挤压变细或粗细不均匀。各组大鼠血流动力学测定结果表明,BDL组大鼠肝门静脉内径、肝门静脉血流速度较Sham组均显著性增加P=0.000)；同时,BDL组肝门静脉压力及肝内血管阻力均显著增高(P=0.000), Ang-(1-7)治疗后肝门静脉压力及肝内血管阻力均较前者显著性下降(P=0.000)。结论1.ACE2-Ang-(1-7)-Mas受体轴能够抑制AngⅡ诱导的肝星状细胞收缩。2. ACE2-Ang-(1-7)-Mas受体轴能够显著抑制肝星状细胞RhoA/ROCK通路上相关分子元件的表达水平,同时上调NO/PKG通路上相关分子元件的表达水平,从而抑制AngⅡ诱导的肝星状细胞收缩。3.Ang-(1-7)能够改善胆管结扎大鼠的肝纤维化；激活肝组织中RhoA/ROCK通路并抑制ROCK活性,同时促进NO/PKG通路中的PKG活性；抑制肝星状细胞收缩并发挥舒血管作用,从而降低门脉高压。