第一章MicroRNAs在乙醇诱导的胃粘膜损伤中的作用研究背景大量饮酒引起急性消化道疾病(如胃出血、胃溃疡等)显著增加,慢性酗酒则可致胃肠功能紊乱、慢性萎缩性胃炎等。乙醇对胃粘膜损伤机制非常复杂,除了直接的化学灼伤外,还涉及诱导细胞凋亡、坏死等。大量研究表明,乙醇可促进胃粘膜合成分泌多种炎症细胞因子和氧自由基,诱导胃粘膜细胞凋亡,但确切机制尚不清楚。MicroRNAs(miRNAs)从转录后水平特异地调控靶基因的表达,其本身的表达调节涉及MAPK/TRBP等信号途径。目前至少有30多个miRNAs被证明参与调节细胞凋亡。本实验将利用乙醇诱导的大鼠胃粘膜损伤模型探讨凋亡相关miRNAs表达水平的变化及其涉及的信号途径,并利用乙醇诱导的胃粘膜上皮细胞凋亡模型进一步确证。方法实验一动物实验SD大鼠随机分成2组：(1)对照组,(2)乙醇组。乙醇组给予1m160%酸化乙醇灌胃,1小时后收集胃组织。Guth改良法计算胃粘膜溃疡指数(UI)；硫代巴比妥酸(TBA)法检测丙二醛(MDA)含量；分光光度法检测过氧化氢酶(catalase)、超氧化物歧化酶(SOD)和天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspase-3)的活性；ELISA法检测TNF-a含量；TUNEL染色检测胃上皮细胞凋亡；Real time PCR检测TNF-α和miR145、miR21、miR181a, miR19a、miR17、miR200c的表达；Western blot检测TRBP、JNK/p-38/ERK表达及磷酸化水平。实验二细胞实验培养人胃上皮细胞株GES-1,分别给予MG132(泛素蛋白酶体通路阻断剂)、SP600125(JNK抑制剂)处理或分别转染miR19a mimics、 miR21mimics、miR200c mimics、miR145inhibitor,再给予5%的乙醇孵育4小时,收集细胞分别检测caspase-3的活性、TNF-a含量、细胞凋亡率(流式细胞法)、miR19a、miR21、miR200c、miR145的表达以及TRBP、JNK表达及磷酸化水平。结果(1)乙醇诱导的大鼠胃粘膜损伤模型中：氧化应激水平和炎症反应均显著增加,表现为胃组织TNF-α、MDA含量增加,SOD、catalase活性下降,伴随细胞凋亡率上升和caspase-3活性上调；抗凋亡miRNAs (miR19a. miR21、miR17)显著下调而促凋亡的miRNA (miR145)则明显上调；JNK蛋白磷酸化水平显著上升,TRBP水平下降,而p38MAPK和ERK蛋白磷酸化水平没有明显变化。(2)乙醇诱导的GES-1细胞凋亡模型中：乙醇诱导的TRBP降解可被JNK或蛋白酶抑制剂取消；乙醇上调miRNA-145表达、下调miRNA-19a、miR21、miR17、miR181a表达作用可被JNK或蛋白酶抑制剂取消；乙醇诱导的细胞凋亡和caspase-3活性可被JNK或蛋白酶抑制剂或miR19a mimics、miR21mimics、miR145inhibitor减轻。结论乙醇诱导的胃粘膜损伤涉及凋亡相关miRNAs表达异常及JNK/TRBP途径。第二章壬酸香草醇酯对乙醇诱导胃粘膜损伤的保护作用及机制研究背景许多药物通过作用于某些受体(如普鲁苯辛阻断M受体、甲氰咪胍阻断H2受体)调节内源性活性物质释放或直接补充内源性活性物质(如前列腺素E)而治疗胃肠道疾病。辣椒素敏感的感觉神经广泛分布于胃肠道,参与胃肠道功能调节。给予辣椒素能激活辣椒素受体(TRPV1)促进降钙素基因相关肽(CGRP)释放减轻消炎痛和乙醇等所致的胃粘膜损伤。但由于辣椒素的神经毒作用和强烈的刺激性,其临床应用(如胃肠道疾病防治)受到限制。甜椒素是近年来在甜椒品种CH-19中发现的辣椒素酯类物质,具有与辣椒素类似的药理作用。由于甜椒素没有刺激性,几乎无神经毒性,因此有取代辣椒素的倾向,用于镇痛、减肥、抗癌等。由于甜椒素来源垄断,价格昂贵,且没有单体,甜椒素的研究及应用受到限制。壬酸香草醇酯是目前已合成的与甜椒素化学结构最接近的甜椒素类似物,通常被称为“合成甜椒素”。壬酸香草醇酯保留了天然甜椒素的某些特性如刺激性低,具有抗氧化作用等。但壬酸香草醇酯是否能激活TRVP1,促进CGRP的释放,目前尚未见报道。本实验将利用乙醇诱导的大鼠胃粘膜损伤模型探讨壬酸香草醇酯是否对胃粘膜损伤具有保护作用；壬酸香草醇酯对胃粘膜的作用是否与激活TRPV1有关；CGRP是否参与介导了壬酸香草醇酯对胃粘膜的作用；壬酸香草醇酯对胃粘膜的作用是否与促进CGRP释放,进而调节相关miRNAs有关。方法健康雄性SD大鼠,体重230-250g,随机分成7组。(1)对照组；(2)乙醇模型组；(3)低剂量壬酸香草醇酯(0.3mg/kg)+乙醇组；(4)高剂量壬酸香草醇酯(1mg/kg)+乙醇组；(5) capsazepine+高剂量壬酸香草醇酯(1mg/kg)+乙醇组；(6)辣椒素(0.3mg/kg)+乙醇组(7)capsazepine+辣椒素+乙醇组；(8)壬酸香草醇酯或辣椒素溶媒+乙醇组。SD大鼠给予相应药物灌胃处理45分钟后,再用1ml60%酸化酒精灌胃,1小时后收集胃组织。分别检测UI, catalase、SOD和caspase-3活性,TNF-a和CGRP含量(ELISA和免疫组化法),细胞凋亡率,miR19a、miR21、miR17、miR145的表达以及TRBP、ERK/JNK表达及磷酸化水平。结果(1)壬酸香草醇酯能显著减轻乙醇诱导的胃粘膜损伤和细胞凋亡,该作用可被辣椒素受体阻断剂取消。(2)壬酸香草醇酯能降低胃组织TNF-α、MDA含量,上调SOD活性,该作用可被辣椒素受体阻断剂取消。(3)壬酸香草醇酯能显著促进胃组织CGRP的释放,该作用可被辣椒素受体阻断剂取消。(4)壬酸香草醇酯能逆转乙醇对miR19a、miR21、miR17、miR145的表达调节作用,该作用可被辣椒素受体阻断剂取消。(5)壬酸香草醇酯能增加ERK磷酸化水平,降低JNK磷酸化水平,减轻乙醇诱导的TRBP降解,该作用可被辣椒素受体阻断剂取消。结论壬酸香草醇酯对乙醇诱导的胃粘膜损伤具有保护作用,其机制涉及激活TRPV1,促进CGRP释放,进而纠正凋亡相关miRNAs的异常表达。第三章CGRP对胃粘膜上皮细胞的保护作用及机制研究背景CGRP是辣椒素敏感感觉神经的主要递质,广泛分布于心血管系统,发挥重要的心血管保护效应。CGRP参与了缺血、热应激、心脏起搏或药物预处理所诱导的心脏保护作用,具有促进内皮细胞增殖,抗内皮细胞凋亡和内皮祖细胞衰老等作用。CGRP亦是重要的胃粘膜保护因子。辣椒素、壬酸香草醇酯对胃粘膜的保护作用与促进CGRP释放密切相关。除舒张血管增加胃肠道血流量外,CGRP对胃粘膜的保护还涉及抗凋亡、抗氧化、抗炎症等作用,但详细机制还有待阐明。CGRP能够显著抑制异丙肾上腺素上调心肌细胞miR-1和下调miR133的表达,减少ROS和抑制心肌细胞凋亡,但CGRP对胃粘膜细胞的保护作用是否涉及对有关凋亡相关miRNAs的表达,尚未见报道。本实验将利用乙醇诱导的胃粘膜上皮细胞凋亡模型探讨：(1)外源性应用CGRP能否抑制乙醇诱导的细胞凋亡；(2) CGRP能否调节与凋亡相关miRNAs的表达；(3)CGRP调节miRNAs表达涉及哪些信号途径。方法(1)探讨CGRP抗乙醇诱导的GES-1细胞凋亡作用及对凋亡相关microRNAs的表达调节。培养的GES-1细胞,分别给予CGRP, CGRP8-37或PD98059处理,再给予5%的乙醇孵育4小时,收集细胞分别检测细胞凋亡率,miR19a、miR21、miR17和miR145表达,TNF-α含量和caspase-3活性。(2)探讨CGRP对miR19a、miR21和miR145表达调节的时效关系。GES-1细胞给予CGRP(10nM)处理0.5、2或6h后,收集细胞检测上述miRNAs的表达水平。(3)探讨ERK信号途径和TRBP蛋白是否涉及CGRP对凋亡相关miRNAs的表达调节。GES-1细胞给予CGRP(10nM)处理0.5或2h,并用CGRP8-37或PD98059干预,收集细胞检测ERK、TRBP蛋白水平和磷酸化水平。结果(1) CGRP能显著抑制乙醇诱导TNF-a生成,降低GES-1细胞凋亡率和caspase-3的活性,该作用可被CGRP-8-37或PD98059取消。(2) CGRP可逆转乙醇对miR19a、miR21、miR17和miR145的表达调节作用,该作用可被CGRP-8-37或PD98059取消。(3)GES-1细胞孵育CGRP后,抗凋亡相关miRNAs (miR19a、 miR17、miR21)表达上调,2h后达高峰,6h开始下降,促凋亡miR145表达下调,在所检测的时间点范围呈时间依赖性趋势。(4)GES-1细胞孵育CGRP2h, ERK和TRBP蛋白水平显著上调,且呈时间依赖性趋势,该作用可被CGRP-8-37或PD98059取消。结论CGRP具有抗乙醇诱导的胃粘膜细胞凋亡作用,其机制涉及激活ERK/TRBP途径,进而纠正凋亡相关miRNAs的异常表达。