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随着人们对牛肉品质的追求,提高肌间脂肪含量成为肉牛育种的重要目标,诱导细胞凋亡的DFFA样效应因子(CIDEC,又称Fsp27)作为调控脂质沉积的重要因子,小鼠等模式动物的研究表明,该基因对于脂肪细胞单房脂滴的形成、维持以及能量储存具有重要作用,同时该基因参与脂肪代谢障碍,胰岛素抵抗型糖尿病,脂肪肝等代谢综合症的调控。分析CIDEC基因在牛上的遗传变异、转录调控及其对牛脂肪细胞的脂肪沉积的调控机制,对于肉牛的标记辅助选择和转基因育种具有重要意义。本研究使用混合DNA池测序、Forced-PCR-RFLP.克隆、原核表达、真核表达、腺病毒的包装、细胞培养等技术,研究了1)CIDEC在秦川牛两个生长时期的组织表达谱,2)CIDEC基因的遗传变异与牛生长性状的关联分析,3)牛CIDEC蛋白的亚细胞定位,4)CIDEC蛋白与PPARg蛋白的互作机制,以及5)CIDEC基因对牛原代脂肪细胞凋亡及糖脂代谢的调控功能,本研究主要取得了以下结果：1. CIDEC在牛的脂肪组织中具有较高的表达水平使用实时定量PCR技术研究了CIDEC在秦川牛犊牛和成年牛不同组织的表达情况,结果显示该基因在这两阶段不同组织的表达趋势相似,都是在脂肪组织中表达量最高,肺、肠次之,而其他组织中的表达量都很低。提示CIDEC在牛的脂质代谢方面有重要作用。2. CIDEC基因启动子区的突变能够影响其转录进而影响生产性能使用混合DNA池测序在5个中国牛品种中发现了CIDEC基因的5’非翻译区存在10个新的SNPs位点,其中SNP2,3,4,6,9完全连锁,SNP8,10完全连锁,关联分析结果表明不同单倍型组合与南阳牛生长性状呈正相关状态。利用双荧光素酶报告系统检测了不同单倍型的转录活性,其中突变位点越少的单倍型转录活性越高,对应的个体生产性能越好。结合顺式作用元件的分析发现这10个SNPs位点可能通过改变转录因子的结合序列(即顺式作用元件)进而改变了该基因的转录水平,最后表现为南阳牛生长性状的改变。牛CIDEC基因的10个SNPs位点可以作为牛分子育种研究的候选位点。3. CIDEC和PPARg蛋白具有不同的亚细胞定位将构建好的真核表达载体pEGFP-C1-CIDEC和pEGFP-C1-PPARg转染到3T3-L1细胞系中发现,CIDEC蛋白位于细胞质中而PPARg蛋白位于细胞核中,说明这两个蛋白不能直接通过蛋白与蛋白的互作来发挥作用。根据其他物种的研究结果,进而推测牛PPARg也是通过结合在CIDEC的5’端的PPRE反应元件上,从转录水平调控CIDEC的表达进而调控脂质沉积。4.牛PPARg可以调控CIDEC的转录使用Genomatix软件预测得到牛CIDEC有2个启动子区(启动子1：-1936到-1336,启动子2：+3552到+4154)和3个PPRE反应元件(-1691到-1669,-1684到-1662,-1677到-1655)。对牛CIDEC启动子不同截短体进行双荧光素酶活性分析,发现启动子1为该基因的核心启动子,其主要活性区域为PPRE反应元件区,加入PPARg激动剂罗格列酮后,PPRE反应元件区转录活性显著升高。这个结果证明了我们在CIDEC细胞定位分析时的推测,牛(?)PARg能够结合在CIDEC启动子区PPRE反应元件上,诱导后者的转录表达,进而参与机体的代谢调控。5.牛CIDEC基因的克隆、序列分析以及原核表达克隆获得的牛CIDEC完整ORF片段大小为669bp,编码222个氨基酸的肽链,预测的蛋白分子量为25KDa,理论等电点为7.97。该蛋白主体结构为螺管结构。起源进化分析发现牛CIDEC蛋白与狗CIDEC蛋白首先聚为一类,再和猪的聚类后与人、黑猩猩、猴的聚为一类,然后再依次和大鼠、小鼠、马、鸡、蟾蜍聚类,与河豚和斑马鱼的距离最远。重组质粒pET-28a(+)-CIDEC表达的最佳条件为37℃,1.0mmoI/L IPTG诱导6h。经Western-Blot证实确为目的蛋白。6.过表达CIDEC会导致牛原代脂肪细胞凋亡构建了牛CIDEC腺病毒超表达载体,并包装、扩繁得到高滴度的CIDEC超表达腺病毒。根据死亡受体基因Fas的表达量变化,发现与人和小鼠上的研究结果一致,过表达CIDEC会诱导牛原代脂肪细胞发生细胞凋亡。7. CIDEC调控牛原代脂肪细胞糖脂代谢筛选出针对牛CIDEC有明显干扰效果的shRNA干扰载体(pENTR/CMV-GFP/U6-CIDEC-sh1),经包装、扩繁得到高滴度的CIDEC干扰腺病毒,滴度为3×108PFU/mL。在牛原代脂肪细胞中,Ad-siCIDEC的干扰效率可以达到72%。牛CIDEC表达量下降后,导致细胞脂质代谢(PPARg、PLIN、HSL)、葡萄糖代谢(GLUT4)、线粒体活性(UCP1)相关的5个基因表达量上升。说明牛CIDEC基因参与机体的糖脂代谢调控,当其表达量下降时,牛脂肪细胞脂解水平升高,葡萄糖平衡受到影响,线粒体数目增多、活性增强,导致脂肪细胞从储存能量向消耗能量转变。