论文部分内容阅读
目的:心脏中不同区域的心肌细胞收缩的协同性(coordinated contraction)是维持正常心脏泵血功能必不可少的因素。左心室壁的心肌细胞可按所处位置不同分为两部分:心外膜下层(Sub-epicardium,EPI)心肌细胞和心内膜下层(Sub-endocardium,ENDO)心肌细胞。左心室壁的去极化是从ENDO侧向EPI侧传导,ENDO心肌细胞负责左心室的起始收缩,因此,相比于EPI心肌细胞,ENDO心肌细胞的收缩要对抗更大的室内压;而稍晚收缩的EPI心肌细胞则需要更短暂地收缩来维持左心室收缩的同步性。破坏左室收缩的同步性势必降低左室泵血效率。从功能正常的左心室中分离的单独ENDO心肌细胞的收缩性能要强于EPI心肌细胞,但其具体机制尚不明朗。心肌细胞的收缩能力主要受胞浆内钙离子浓度[1]和肌小节蛋白(sarcomeric proteins)活性的调节。最新的科研进展表明,脂肪酸结合蛋白3(Fatty-acid-binding protein 3,FABP3),能够抑制大鼠心肌细胞的钙释放。FABP3在心肌组织中高表达,参与脂质代谢,维持心脏能量供应。我们的前期数据提示左心室壁内的FABP3蛋白表达水平存在跨壁异质性(EPI>ENDO),但是FABP3是否参与调节心肌细胞收缩能力的跨壁异质性尚不清楚。MLCK3(myosin light chain kinase 3)是心肌特异型肌球蛋白轻链激酶,于2008年首次被发现于小鼠心肌细胞内。肌球蛋白轻链的磷酸化会增加心肌细胞收缩的钙敏感性以及加快心肌细胞收缩的动力学。已有研究表明肌球蛋白轻链的磷酸化在左心室室壁的不同区域中存在异质性(EPI>ENDO),但是MLCK3的蛋白表达水平是否存在异质性,以及是否存在跨壁异质性尚不清楚。综上所述,我们提出如下假设:FABP3和MLCK3的跨壁异质性参与左心室壁心肌细胞收缩跨壁异质性的形成。为了验证我们的假设,我们设计了以下实验。方法:1实验动物以本实验室使用健康c57bl/6小鼠,雄性,8-10周龄。饲于spf级环境中。2westernblot检测心肌epi和endo组织的fabp3,mlck3的蛋白表达3用ionoptix单细胞动缘检测系统检测epi和endo心肌细胞的收缩功能4通过钙成像技术研究小鼠左室心肌细胞钙瞬变的动力学变化。5观察给药fabp3条件下epi和endo细胞钙火花的测量6统计学处理和相关分析数据用mean±se表示,采用spss13.0软件进行统计学处理分析,检验以p<0.05为差异有显著性意义。结果:1验证c57bl/6小鼠左室心肌细胞收缩能力的跨壁异质性1.1endo心肌细胞的收缩幅度显著高于epi心肌细胞,两组数据的差异有统计学意义(p<0.05)。该数据提示,epi心肌细胞的收缩能力显著性小于endo心肌细胞。1.2对左室epi与endo心肌细胞收缩速率的比较,epi心肌细胞的最大收缩速率略小于endo心肌细胞,但两组数据的差异无统计学意义。该数据提示,epi心肌细胞与endo心肌细胞的收缩速率基本一致。1.3我们测量了epi心肌细胞与endo心肌细胞的从收缩起始达到最大收缩幅度的时程(达峰时间)。epi心肌细胞的达峰时间小于endo心肌细胞,两组数据的差异有统计学意义(p<0.05)。该数据提示,小鼠心肌左室壁内,epi心肌细胞收缩时程短于endo心肌细胞。2检测小鼠左室epi心肌细胞与endo心肌细胞钙瞬变动力学变化2.1首先我们分析了钙瞬变的幅度。fluo-4或者fura-2两种荧光染料测量的结果均显示,epi心肌细胞的钙瞬变幅度显著性的小于endo心肌细胞,两组数据的差异有统计学意义(p<0.05)。2.2通过对心肌细胞钙瞬变的下降进行双指数曲线拟合,我们分析了钙离子浓度下降的时间常数并对epi心肌细胞与endo心肌细胞进行了比较。小鼠左室epi心肌细胞钙离子浓度下降的时间常数(tau)显著性的小于endo心肌细胞,两组数据的差异有统计学意义(p<0.05)。该数据提示,小鼠心肌左室壁epi心肌细胞肌浆网钙离子泵(serca)活性大于endo心肌细胞。3fabp3对小鼠心脏左室epi心肌组织与endo心肌组织及细胞的作用。我们的前期数据提示fabp3抑制心肌细胞钙瞬变幅度以及细胞收缩幅度。因此接下来我们检测了小鼠左室收缩以及钙调控异质性是否与fabp3相关。3.1我们检测了epi心肌组织与endo心肌组织fabp3蛋白表达水平并对两种数据进行了比较。通过westernblot检测出epi心肌组织fabp3的表达水平显著性高于endo心肌组织,两组数据的差异有统计学意义(p<0.05)。该数据提示,小鼠左室心肌组织存在fabp3蛋白表达水平异质性。3.2接下来我们研究了fabp3对心肌细胞钙火花频率的调节。fabp3灌流组中心肌细胞内的钙火花频率显著性的高于对照组,两组数据的差异有统计学意义(p<0.05)。该结果提示,fabp3导致了ryr2介导的钙流失。3.3通过孵育钙敏感荧光染料fluo-4,正常台式液灌流,观察钙火花。epi心肌细胞组的钙火花频率显著性的高于endo心肌细胞组,两组数据的差异有统计学意义(p<0.05)。该数据提示,小鼠左室epi心肌细胞舒张期肌浆网钙流失情况比endo心肌细胞中严重。3.4接下来我们分别研究了fabp3在epi心肌细胞和endo心肌细胞中对钙瞬变的调节作用并进行了比较。fabp3(0.5nmol/l)对于epi心肌细胞钙瞬变幅度的抑制作用显著性的强于其在endo心肌细胞中的作用,两组数据的差异有统计学意义(p<0.05)。该结果提示,epi心肌细胞钙调控对于fabp3刺激更加敏感。4mlck3跨壁异质性参与调节左室心肌细胞跨壁收缩梯度(transmuralcontractilegradient)4.1首先我们检测了epi心肌组织与endo心肌组织mlck3蛋白表达水平并对两种数据进行了比较。在小鼠左室epi心肌组织中mlck3的平均蛋白表达水平显著性高于endo心肌组织,两组数据的差异有统计学意义(p<0.05)。该数据提示,小鼠左室心肌组织存在mlck3蛋白表达水平异质性。4.2接下来我们研究了MLCK3分别在EPI心肌细胞和ENDO心肌细胞中参与收缩功能调控的程度。MLCK3的抑制剂ML-7对于EPI心肌细胞收缩幅度的抑制作用显著性的强于其在ENDO心肌细胞中的作用,两组数据的差异有统计学意义(P<0.05)。该结果提示,相对于ENDO心肌细胞,EPI心肌细胞的收缩更加依赖于MLCK3活性。结论:1 EPI心肌细胞的收缩能力与收缩时程显著小于ENDO心肌细胞。2检测小鼠左室EPI和ENDO心肌细胞钙相关动力学的变化(1)EPI心肌细胞的钙瞬变幅度显著性的小于ENDO心肌细胞。(2)小鼠心肌左室壁EPI心肌细胞肌浆网钙离子泵活性大于ENDO心肌细胞。3 FABP3对小鼠左室EPI和ENDO的影响(1)小鼠左室心肌组织存在FABP3蛋白表达水平异质性。(2)小鼠左室EPI心肌细胞舒张期肌浆网钙流失情况比ENDO心肌细胞中严重。(3)EPI心肌细胞钙调控对于FABP3刺激更加敏感。4 MLCK3调节左室心肌细胞跨壁收缩梯度(1)小鼠左室心肌组织存在MLCK3蛋白表达水平异质性。(2)EPI心肌细胞的收缩更加依赖于MLCK3活性。