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前言在近些年癫痫发病机制的研究中,兴奋性和抑制性神经系统之间的功能失衡成为了研究热点之一,其中兴奋性神经递质谷氨酸及其代谢过程的变化引起了学者的广泛关注。作为谷氨酸清除唯一途径的谷氨酸转运体在谷氨酸再摄取、突触的正常传递及保护神经元免受神经兴奋性损害等方面都具有重要作用。国内外的大量研究表明谷氨酸转运体表达与功能的改变与癫痫的发生密切相关。在已克隆出的五种兴奋性氨基酸转运体中,GLT-1(EAAT2)是一种胶质细胞型转运体,提供了超过90%总体谷氨酸的吸收,在谷氨酸转运中起到了一个中心作用。EAAC1(EAAT3)是一种神经元型转运体,在降低突触间隙谷氨酸浓度的同时,还为γ-氨基丁酸(GABA)的合成提供前体。自发性癫痫大鼠(spontaneously epileptic rat,SER)为双基因突变大鼠,由tremor(tm)大鼠杂合子(tm/+)和zitter(zi)大鼠纯合子(zi/zi)杂交得到。生后8周,SER自发性地出现癫痫大发作和小发作,其对于抗癫痫药物的反应同癫痫患者类似,是研究遗传性癫痫的理想动物模型。本研究通过比较SER和正常Wistar大鼠皮质和海马中GLT-1(EAAT2),EAAC1(EAAT3)在mRNA和蛋白水平的变化,为揭示兴奋性氨基酸代谢在遗传性癫痫发病机理中的作用提供理论依据。材料与方法1、动物、试剂与仪器SER和正常Wistar大鼠11-13周龄,♀、♂不限,在标准条件下饲养(12小时交替照明,湿度为50%～70%,24℃),动物自由进食饮水,每组5只。TaKaRaRNAPCR Kit(AMV)试剂盒,兔抗鼠GLT-1,EAAC1多克隆抗体(美国santa公司),免疫组化SP试剂盒,DAB显色试剂盒(北京中杉生物技术有限公司)。PCR扩增仪(美国Biometra),DYY-5型稳流稳压电泳仪(北京六一仪器),Hoefer miniVE垂直电泳、印迹系统(瑞典Amersham Biosciences公司)。2、RT-PCR方法检测GLT-1、EAAC1 mRNA表达TRIzol法提取SER和正常Wistar大鼠皮质和海马中GLT-1、EAAC1总RNA,参照Takara AMV RT-PCR试剂盒说明书进行RT-PCR反应。产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后,扫描结果分析灰度值。3、Western blotting方法检测GLT-1、EAAC1蛋白表达提取SER和正常Wistar大鼠皮质和海马中GLT-1、EAAC1蛋白,考马斯亮蓝法蛋白定量,经10%SDS-PAGE凝胶电泳后将蛋白转印至PVDF膜上,一、二抗孵育,ECL化学发光法显色。4、免疫组织化学方法定位GLT-1、EAAC1蛋白表达SER和正常Wistar大鼠脑组织经灌流固定后石蜡包埋,制作石蜡切片,抗原修复,一、二抗孵育,DAB显色,图像采集与分析。5、统计学分析各组结果以平均数±标准差表示,两组间比较用t检验。实验结果1、RT-PCR结果显示:SER皮质中EAAC1 mRNA的表达显著低于正常Wistar大鼠(p＜0.01),SER皮质中GLT-1 mRNA,SER海马中GLT-1、EAAC1 mRNA与正常Wistar大鼠相比无统计学差异(p＞0.05)。2、Western blotting结果显示:SER皮质中GLT-1蛋白的表达低于正常Wistar大鼠(p＜0.05),SER皮质中EAACl蛋白的表达显著低于正常Wistar大鼠(p＜0.01),SER海马中GLT-1蛋白的表达显著高于正常Wistar大鼠(p＜0.01)。SER海马中EAAC1蛋白的表达与正常Wistar大鼠相比无统计学差异(p＞0.05)。3、免疫组织化学结果显示:SER和正常Wistar大鼠皮质和海马中GLT-1、EAAC1均有表达,且均定位于细胞膜上。结论1、SER皮质中EAAC1在mRNA和蛋白水平表达均下调。2、SER皮质中GLT-1蛋白表达下调,海马中GLT-1蛋白表达上调。3、SER皮质和海马中GLT-1、EAAC1均有表达,且均定位于细胞膜上。4、SER皮质中GLT-1、EAAC1表达下调可能会促进癫痫的发生。5、SER海马中GLT-1表达上调可能是一种代偿性神经保护机制。