水稻恶苗病是一种重要的水稻病害,其产生的毒素威胁食品安全。在藤仓赤霉复合种（Gibberella fujikuroi species complex, GFC）中有三种交配群和水稻恶苗病相关：（1）交配群A（无性态为Fusarium verticillioides即F. moniliforme）;（2）交配群C（无性态为F. fujikuroi）;（3）交配群D（无性态为F. proliferatum）。其中,藤仓镰孢菌（F. fujikuroi）在1890年首次从水稻病株上被发现并被鉴定为主要的水稻恶苗病病原菌。苯并咪唑类杀菌剂是一种具有广谱、高效、低毒的内吸性杀菌剂,主要包括苯菌灵、多菌灵（MBC）、噻菌灵和甲基硫菌灵。这类药剂主要作用于病原菌的微管蛋白尤其是β微管蛋白,能够阻止菌体细胞纺锤体的形成,从而抑制有丝分裂。在1970年以前,苯并咪唑类杀菌剂能够很好地防治水稻恶苗病。但是,由于该类药剂的长期单一使用,导致抗药性产生,防治效果日趋式微。为此,本文通过构建藤仓镰孢菌（F.fujikuroi）β2微管蛋白基因的敲除和回复突变体,揭示其产生多菌灵抗药性的分子机制；建立抗药性菌株快速分子检测技术。本实验室已有研究表明：多菌灵敏感菌株MIC值小于5 μg/ml,中抗菌株MIC值介于50-100μg/ml,高抗菌株MIC值大于100μg/ml；藤仓镰孢菌（F. fujikuroi）的β1微管蛋白与多菌灵抗性无关。主要研究结果如下：1. F. fujikuroi β2微管蛋白基因突变导致其对多菌灵产生抗药性。根据藤仓镰孢菌的近缘种拟轮枝镰孢菌（F. verticillioides）测序菌株7600核基因组的β2微管蛋白核苷酸序列（Broad Institute登录号：FVEG₀5512.3）设计了用于克隆F. fujikuroi β2微管蛋白基因的全长。藤仓镰孢菌（F. fujikuroi）β2微管蛋白基因全长1704bp,含有6个内含子,编码由448个氨基酸残基组成的蛋白质,分子量为50.16 kDa, G+C含量为52.46%,等电点为4.38。藤仓镰孢菌β2微管蛋白与β1微管蛋白的氨基酸序列同源性为77%。分别克隆了56株多菌灵抗性菌株和12株多菌灵敏感菌株β2微管蛋白基因的全长,再对他们进行了核苷酸序列比对分析。结果表明：多菌灵中抗菌株β2微管蛋白基因第200位TTC（phe）→TAC（tyr）和第235位GGC（gly）→GGT（gly）发生突变；高抗菌株β2微管蛋白基因第198位GAG（glu）→GTG（val）和第235位GGC（gly）→GGT（gly）发生突变。为了探究β2微管蛋白氨基酸突变是否与多菌灵抗药性相关,利用正负筛选标记（hph和hsv-tk）和同源双交换构建了对多菌灵不同敏感性水平藤仓镰孢菌（F. fujikuroi）β2微管蛋白基因原位敲除和回复突变体,经过PCR和Sorthern杂交等遗传学验证,在离体条件下测定了亲本菌株和突变体对多菌灵敏感性以及生物学表型。结果表明：不同敏感性水平F. fujikuroi菌株β2微管蛋白基因敲除突变体对多菌灵药剂均表现为超敏感（多菌灵敏感菌株EC50值1.08→0.302μg/ml,多菌灵中抗菌株EC50值2.41→0.300μg/ml,多菌灵高抗菌株EC50值3.32→0.306μg/ml,敲除突变体MIC值均为1μg/ml）,产孢能力下降50-80%,对番茄果实致病力降低20-30%,菌丝生长速率下降6.5-17.1%。将对多菌灵不同敏感性水平菌株β2微管蛋白基因分别回复到敲除突变体后,回复突变体均获得了对多菌灵相应的敏感性水平和其他生物学表型。2.所建立的PIRA-PCR检测技术能够快速鉴别藤仓镰孢菌对多菌灵不同水平的抗药性。根据藤仓镰孢菌（F. fujikuroi）的应微管蛋白基因的突变位点,设计特异性引物对扩增待测菌株的β2微管蛋白基因,再利用巢式PCR引物对引入限制性内切酶Acc Ⅱ和PmaC I的酶切位点,并进行酶切、电泳,鉴定抗药性基因型。与传统鉴别方法需要7-8天时间相比,PIRA-PCR能够在10小时内快速、准确地鉴别出藤仓镰孢菌菌株对多菌灵抗药性水平。3.所研发的ASO-PCR检测技术能够快速鉴别藤仓镰孢菌对多菌灵抗、感表型,但是不能确定待测菌株的基因型。对68个单孢菌株β2微管蛋白基因克隆、比对分析,发现在该基因的第235位密码子（第1006位核苷酸）在敏感和抗性菌株中存在明显差异。通过对田间藤仓镰孢菌菌株抗药性频率监测发现,多菌灵高抗菌株在田间抗性群体中占主导地位（55%）,因此,快速检测田间抗性频率对于农业生产具有重要意义。根据F.fujikuroi β2微管蛋白基因第1006位核苷酸（第235位氨基酸）突变的基因型,设计特异性引物对,通过allele-specific oligonucleotide PCR (ASO-PCR滞测方法将多菌灵敏感菌株和抗性菌株加以区分。相比于传统药剂检测方法,该ASO-PCR技术能够迅速（6-7小时）并准确地区分多菌灵敏感与抗性菌株,准确率为100%。