我国海域辽阔,海藻资源非常丰富,是全世界最大的海藻生产国,年产量占世界总产量的一半以上。作为海藻工业主体产品的褐藻酸虽然已广泛应用于食品、医药、化工等领域,但在生产加工技术、综合利用水平、产业化程度、产品种类及质量上与国外相比还有较大差距,仍主要停留在初级加工阶段,产品附加值低。因此,开展新工艺、新技术、新产品的研究与开发是实现海藻生物资源高值化利用的关键。褐藻多糖和褐藻寡糖由于具有抗肿瘤、免疫调节、降血糖血脂等多种生物活性,目前已成为国际上褐藻酸产品深入研发、高附加值利用的代表方向和研究热点。褐藻酸裂解酶作为工具酶酶解生产褐藻寡糖和低分子量多糖具有降解条件温和,过程可控,得率高等优点,已逐渐取代传统酸解方法而成为褐藻寡糖生产的主要方式。另外,由于褐藻酸裂解酶在褐藻遗传工程研究及医学等领域也具有重要的生物学作用,因此其研究有着深远的基础理论意义和应用价值。基于此,本论文从褐藻酸裂解酶高产菌株筛选、分离纯化、基因克隆、异源表达和性质分析等几个方面对海洋细菌褐藻酸裂解酶进行了系统研究,主要研究内容和结果如下。一、产褐藻酸裂解酶菌株筛选利用褐藻酸钠为单一碳源的分离培养基从腐烂海带中分离筛选得到一株产褐藻酸裂解酶活性较高的海洋菌株,通过形态观察、生理生化特性研究和16SrDNA序列分析,鉴定该菌株属于假交替单胞菌属,命名为Pseudoalteromonas sp. SM0524。菌株筛选过程中,使用Lugol氏碘液染色法取代传统乙醇和氯化十六烷毗啶等透明圈染色方式,使筛选结果更具直观性,而且更加低毒安全,有效地提高了筛选效率。同时对Somogyi-Nelson酶活测定方法在试剂配比和反应条件等方面进行了改进,确立了适合于本研究的褐藻酸裂解酶活性快速测定方法。二、P. sp. SM0524分泌的褐藻酸裂解酶的分离纯化和性质研究采用超滤浓缩、阴离子交换层析和凝胶过滤层析,分离纯化了P. sp. SM0524分泌的褐藻酸裂解酶。SDS-PAGE分析表明,经过两步层析,得到了一个电泳纯的褐藻酸裂解酶,分子量约32 kDa。酶的纯化倍数和得率分别为73.4倍和45.1%。对该褐藻酸裂解酶的酶学性质进行了研究,结果表明,该酶酶活最适反应温度为50℃,但热稳定性较低,50℃下酶活性半衰期为20 min；在广泛pH缓冲液中,最适反应pH为8.5,在pH 7.0～10.0范围内50℃保温20 min,残留酶活50%以上,pH 8.0下最为稳定；在磷酸缓冲液中,最适反应pH为7.0～7.5。Na+、Ba2+等对酶活性具有明显促进作用,Cu2+和Sn2+对酶活性有一定抑制作用,EDTA对酶活性有明显抑制作用,表明该褐藻酸裂解酶为金属酶。该酶对NaCl耐受程度较高,NaCl浓度1.0 M时,残留酶活性大于75%,具有典型海洋酶的特征；通过对酶的底物特异性研究,发现该褐藻酸裂解酶为双功能酶,即可同时降解聚甘露糖醛酸(PM)和聚古罗糖醛酸(PG),具有广泛的底物特异性,对褐藻酸钠、PM、PG催化活性顺序为褐藻酸钠>PM>PG,酶反应动力学研究表明酶对PG底物亲和性最强。通过薄层层析(TLC)和电喷雾质谱(ESI-MS)分析酶解产物,结果显示该酶酶解褐藻酸钠和PM的产物主要为二糖和三糖,酶解PG产物主要为三糖和四糖。三、P.sp.SM0524褐藻酸裂解酶基因克隆和序列分析1、褐藻酸裂解酶基因克隆根据对纯化的褐藻酸裂解酶N端氨基酸序列和质谱分析结果,以及对NCBI数据库中Mr30000类褐藻酸裂解酶保守序列分析结果,设计了两组引物。通过PCR和TAIL PCR从P. sp. SM0524全基因组中克隆得到两个褐藻酸裂解酶全基因序列,分别命名为aly-SJ01和aly-SJ02。aly-SJOl全长1089 bp,编码362个氨基酸；aly-SJ02为已纯化的褐藻酸裂解酶基因,全长1203 bp,编码400个氨基酸。2.褐藻酸裂解酶序列分析结构域预测分析表明,基因aly-SJ01编码的蛋白ALY-SJ01含两个结构域：信号肽和催化结构域。通过BLAST序列比对分析,ALY-SJ01属多糖裂解酶PL7家族,与全基因组已测序的两株菌Alteromonadales bacterium TW-7以及Pseudoalteromonas haloplanktis TAC125中预测的褐藻酸裂解酶氨基酸序列分别有93%和83%的相似性。ALY-SJ01与已报道褐藻酸裂解酶的同源性都较低,ALY-SJ01与Vibro halioticoli IAM14596T分泌的褐藻酸裂解酶相似性最高,相似性仅为41%。因此,ALY-SJ01是PL7家族中的一个新酶。以数据库中褐藻酸裂解酶的结构(2Z42A.pdb)为模型,对ALY-SJ01进行了同源模建。模建结果表明,ALY-SJ01富含β折叠,并有大量无规则卷曲和少量的α螺旋,催化腔由p折叠围绕而成。ALY-SJ01结构中大量的无规则卷曲可能是导致其稳定性较低的主要原因之一。结构域预测分析表明,基因aly-SJ02编码的蛋白ALY-SJ02包含3个结构域：信号肽、多糖吸附结构域(CBM)和催化结构域,在催化结构域和多糖吸附结构域中间有一段Linker。根据N端测序结果表明,ALY-SJ02成熟后,其N端的信号肽和多糖吸附结构域都被切掉,形成含有243氨基酸残基的成熟酶。通过BLAST序列比对分析,ALY-SJ02属PL18家族,与Pseudoalteromonas.sp.IAM14594分泌的胞外褐藻酸裂解酶相似性75%,其中催化结构域相似性非常高,而多糖吸附结构域序列差异较大；ALY-SJ02 C端催化结构域的233个氨基酸与Alteromonas sp.272中分离到的一个成熟褐藻酸裂解酶相似性达99%。以数据库中Alteromnas sp.272的褐藻酸裂解酶(1J1T.pdb)晶体结构为模型,对ALY-SJ01进行了同源模建。模建结果表明,ALY-SJ02富含β折叠,少量的α螺旋,有一个由β折叠围绕而成的催化腔。四.P.sp.SM0524褐藻酸裂解酶重组表达和重组酶性质研究1、aly-SJ01重组表达和重组酶性质研究将褐藻酸裂解酶基因aly-SJ01在E.coli BL21(DE)中进行了重组表达和纯化,重组酶命名为Aly-SJ01。酶学性质研究结果表明,重组酶Aly-SJ01最适反应温度30℃,5℃下仍具有19%残留酶活；热稳定性很低,30℃以上快速失活；Tm值很低,为37℃。这些结果表明,Aly-SJ01是一个适冷酶。据我们所知,这是目前唯一报道的适冷褐藻酸裂解酶。Aly-SJ01在50 mM Tris-HCl缓冲液中的最适反应pH为8.5,pH7.0-9.5之间酶较稳定,能够保持70%以上活性,在不同缓冲液的同一pH条件下表现出不同酶活性；Aly-SJ01具有较强的盐耐受能力,NaCl浓度为1.2 M时仍有50%以上残留酶活,表现出该酶对海洋环境的适应；多种金属离子如Mg2+、B32+、Mn2+等在低浓度时对Aly-SJ01酶活有明显促进作用；SDS和EDTA对酶活性抑制作用明显,浓度为2 mM即可使酶完全失活。底物特异性分析结果显示,Aly-SJ01为专一性PM裂解酶(EC 4.2.2.3),酶解PM主要产生二糖、三糖和四糖。2、aly-SJ02重组表达和重组酶性质研究将褐藻酸裂解酶基因aly-SJ02在大肠杆菌BL21(DE)中进行了重组表达,对发酵液中成熟酶的产量分析表明,异源表达的重组酶Aly-SJ02产量达到80 U/ml,较野生菌株的产量有明显提高。利用离子交换层析和镍亲和层析对发酵液中的重组酶进行了纯化,并对重组酶Aly-SJ02性质进行了研究。研究结果表明,重组酶Aly-SJ02的最适反应温度、最适反应pH等性质与野生酶基本一致,这表明重组表达的Aly-SJ02具有与野生酶一样的结构。Aly-SJ02的成功异源表达为对其进一步的研究与开发奠定了基础。