目的：应用功能蛋白质组学的研究方法初步鉴定小鼠肝细胞中表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)信号转导网络的磷蛋白组成成分或效应蛋白/酶，对这些磷蛋白在持续高浓度的EGF(10ng/μl，生理浓度为10-3～10-1ng/μl)刺激不同时间点的磷酸化水平进行半定量分析(获得相对反应速度数据)，在细胞整体表达的水平上动态的观察分析细胞内激酶、信号蛋白等在EGF信号转导过程中发生的动力学变化，以探讨EGF对小鼠肝细胞信号转导的动力学改变特点，并进一步分析EGF信号转导网络中信号蛋白、信号途径之间的相互交流、相互影响、相互作用和相互制约的关系及其对信号转导最终生理效应的影响。 方法：本实验采用肝组织块培养法，原代培养小鼠肝细胞作为实验材料；32P同位素标记对照组与刺激组小鼠肝细胞磷蛋白；给予刺激组高浓度EGF(10ng/μl)分别作用0min、5min、20min、60min、120min等不同时间后，液氮终止反应；裂解细胞，收集蛋白，Bio-Rad DC法定量蛋白；根据蛋白质的等电点和分子量的不同，采用双向凝胶电泳(一向采用pH3～10的固相pH梯度等电聚焦电泳，二向采用10％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离蛋白；电泳结束后，固定凝胶块并进行干胶处理，将干胶片与X光胶片一起放入摄影暗匣，在-70℃冰箱中曝光7日：于自动洗片机内冲洗X光胶片，获得不同时间点的双向凝胶电泳放射自显影图谱。采用PDQuest 2D分析软件分析电泳图谱中磷蛋白的等电点及分子量，将各磷蛋白点的实验数据与Swiss-Prot/TrEMBL蛋白质数据库、磷蛋白数据库(PPDB)及自建磷蛋白数据库进行分子量、等电点及磷酸化状态的相互比较，初步确定小鼠肝细胞EGF信号转导网络的组成成分或效应蛋白/酶等相关磷蛋白。运用PDQaaest 2D分析软件分析相关磷蛋白在EGF刺激不同时间点的磷酸化水平的变化情况，绘制出相应的时间动力学曲线。 结果：①双向凝胶电泳放射自显影图谱显示，对照组与刺激组磷酸化蛋白点数目基本相同，大约有100个蛋白点，分子量在20～120 kDa，丰度较高的蛋白点主要集中在pH4～7的范围内。②经PDQuest 2D分析，并结合Swiss-Prot/TrEMBL及PPDB等数据库资源初步检测到参与EGF信号转导且丰度较高的相关磷蛋白有8种，分别是EGFR底物15(Eps15)、信号转导子(STAT1)、热休克蛋白86(HSP86)、蛋白激酶Ca(PKCa)、细胞外信号调节激酶2(ERK2)、MAPK磷酸酶3(MKP3)、14-3-3蛋白α/β(14-3-30α/β)、MAPK激酶6(MAPKK6)等；糖代谢相关蛋白有磷酸果糖激酶-1同工酶B(PFK-B)及糖原合酶底物(glycogenin-1)2种。③在细胞整体水平上，在持续高浓度的EGF刺激下，不同EGF相关信号转导蛋白的磷酸化时间动力学行为表现不同，大多数磷蛋白表现为峰型，其动力学曲线最高峰值在5分或20分；但少数磷蛋白的动力学行为却表现为持续活化状态，在120分钟后仍处于较高的磷酸化水平，如Eps15和ERK2。 结论：①在细胞整体水平，持续高浓度的EGF刺激下，小鼠肝细胞内EGF信号转导途径中大多数的磷蛋白都表现为激活后很快恢复到未刺激状态。表明在细胞整体水平，信号途径中磷蛋白表现的动力学行为是受到整个信号转导系统整合后的动力学行为。从而可以认为，EGF信号转导途径与其他信号转导途径之间存在广泛的相互作用及相互交流，并且这种相互作用对其最终生理效应有影响；②EGF在生理浓度下可能表现为自适应控制作用而正常发挥其调节细胞的生长、存活、增殖和分化等功能，但在高浓度长时间刺激下，某些磷蛋白则表现为持续活化状态，如Eps15和ERK2。可见，在高浓度的EGF持续刺激下，EGF信号网络系统中的某些信号蛋白的生理功能将会发生改变，这些改变可能与EGF及其受体高表达的肿瘤的发生发展有密切关系。