论文部分内容阅读
蛙皮素受体亚型-3(BRS-3)是蛙皮素样肽家族的成员之一,研究显示其可能在肺和气道上皮应激反应调节中发挥一定作用。蛙皮素受体激活蛋白(BRAP)是本课题组前期实验中发现的能与BRS-3相互作用的新蛋白。本课题组前期研究提示BRAP参与应激条件下应激信号的转导和应激条件下某些特定生理功能的调控。为了进一步研究BRAP的作用机制并深入探讨其生物学功能,本研究通过酵母双杂交技术进行了BRAP相互作用蛋白的筛选并将已筛选的蛋白根据其功能进行归类,推测BRAP与细胞氧化代谢功能具有着密切的联系并进行了一系列细胞氧化代谢相关的检测。 目的:筛选与BRAP相互作用的蛋白并研究其对细胞氧化代谢功能的影响,以进一步探究BRAP的功能及其作用机制。 方法: (1)酵母双杂交筛选BRAP相互作用蛋白。 (2)分析筛选出可能的BRAP相互作用蛋白,并克隆其基因全长用酵母双杂交初步验证初筛的与氧化代谢有关的基因产物与BRAP之间的相互作用。 (3)采用活性氧探针法检测BRAP对静息状态下和臭氧攻击后HEK293T细胞内活性氧水平的影响。 (4)利用报告基因pARE-Luc探究BRAP高表达对HEK293T细胞内氧化应激水平的影响。 (5)流式细胞术及荧光分光光度计检测BRAP对HEK293T细胞凋亡的影响。 (6)通过化学发光法检测BRAP对臭氧应激后反映细胞凋亡的线粒体途径caspase-9活性的影响。 (7)利用荧光分光光度计检测BRAP对臭氧应激后HEK293T细胞线粒体膜电位的影响。 结果: (1)获得20个可与BRAP相互作用蛋白的基因,其中包括一些参与细胞氧化代谢活动的酶类。 (2)成功克隆部分目的基因全长,并初步验证了3个能与BRAP发生相互作用的目的基因。 (3) BRAP高表达可以降低臭氧应激后细胞内活性氧簇(ROS)的含量,并且降低细胞内氧化代谢水平。 (4) BRAP高表达可以减少臭氧应激后的细胞凋亡,并且维持细胞应激状态下的线粒体膜电位。 (5) BRAP高表达能减少细胞内caspase-9的活化,一定程度上抑制了细胞的凋亡。 结论: (1) BRAP能通过与细胞内多种蛋白发生相互作用,对HEK293T细胞内的氧化代谢产生作用。 (2) BRAP能显著降低氧化应激状态下HEK293T细胞内的氧化代谢水平,减轻氧化损伤从而减少细胞凋亡。