研究背景角膜供体的缺乏使得许多学者致力于角膜替代物的研发。早期的角膜替代物以人工角膜为代表。近年来,随着组织工程领域的兴起与发展,组织工程角膜的构建与应用已成为国内外学者研究的热点。组织工程角膜的构建主要包括支架材料的构建与种子细胞的选取。目前,很多天然及合成材料如羊膜、交联胶原已作为支架材料应用于组织工程角膜的构建,虽然这些材料具有良好的生物相容性,移植后可维持眼球的完整,并能在一定程度上恢复角膜的透明度,但由于其缺少天然角膜的构象,依然存在很多缺点,例如透明度不够,不能耐受缝线切割,机械弹性性能较差等。理想的组织工程角膜不仅应具有良好的生物相容性,还应高度模仿天然角膜的重要结构特征:高度规则的板层胶原排列。因为角膜规则的胶原排列是角膜透明性、机械弹性的结构基础,是角膜执行生理功能的重要因素之一。然而,这一目标很难通过胶原交联的方法实现,其他组织如羊膜、口腔粘膜等亦与角膜的胶原排列结构差别较大,直接导致其机械弹性性能、透明度欠佳。去细胞组织工程真皮的研发与成功应用为组织工程角膜支架材料的制备提供了新的思路。在彻底去除细胞的同时,较好的保留细胞外基质成分是去细胞方法的关键要素。要彻底的去除细胞,必须使组织松解,使细胞及细胞碎片有充分的空间从组织中游离出来,这必然会使组织原有的胶原支架变得松散,失去原有的排列结构。但这对于无透明度、胶原排列规则度这一特殊要求的组织来讲,并无大的影响。此外,这种疏松的胶原组织还易于形成多孔的结构,适合体外接种细胞,进行组织工程产品的构建。然而,角膜具有不同于其他一切组织的鲜明特点:透明。这也是角膜执行其生理功能的基础。而角膜的透明度源于其高度规则的基质层胶原排列。因而,从透明度保持的角度上讲,组织工程角膜的制备必须力求具有规则的胶原排列。但规则的胶原排列必然导致支架材料内部孔隙率低,不利于角膜基质细胞的体外接种,与传统的组织工程多孔支架材料的理念相悖。为了找到适合组织工程角膜的制备方法,本实验对两种不同方法制备的去细胞猪角膜基质进行了比较,一种方法遵循传统的理念,制成多孔的支架材料,另一种方法力求恢复角膜胶原的规则排列,提高材料的透明度。内容与方法去细胞处理目的:去除猪角膜细胞,去除其抗原性,制备生物相容性良好的异种组织工程角膜支架材料。方法:于当地屠宰场取新鲜猪眼球,保留1mm宽巩膜缘剪下角膜,4℃冰箱内纯水中充分溶胀后,剖取角膜的前1/3板层,-80℃冰箱中冷冻15min,之后缓慢融解,冻融过程重复3次。胰酶、DNA酶、NaOH溶液中分别浸泡30min后充分洗涤。结果:大体观,去细胞猪角膜基质透明度下降,组织水肿;组织学检测显示,细胞去除彻底,胶原及前弹力层保留完整。胶原间距较正常角膜组织增大。结论:溶胀-冻融-酶-NaOH法适合角膜组织的去细胞处理。材料的干燥目的:去除材料中的水分,使材料易于保存;恢复角膜组织原有的胶原排列(晾干)或在材料内部制造孔隙(低压冻干)。方法:1.冻干法:将脱细胞角膜于部分角膜置于-80℃冰箱预冻,30min,转入低压冻干机中,真空干燥,16h,获得冻干脱细胞猪角膜基质(l-PACS);2.晾干法:将脱细胞角膜平铺于培养皿中,于超净台中风干,每3min将角膜翻转一次,以保持角膜平滑,共12h,获得晾干脱细胞猪角膜基质(a-PACS)。角膜单片密封于无菌包装袋中,Co60照射灭菌,4℃冰箱保存备用。结果:组织学检测显示,晾干材料的胶原呈板层排列,较为规则,但孔隙较少;冻干材料呈多孔状,胶原排列较紊乱。结论:脱细胞后,材料经晾干处理可恢复其原有的规则胶原排列;冻干处理后则呈多孔状。材料的比较目的:为了进一步探讨两种材料作为组织工程角膜支架材料的应用价值及其二者之间的差异。方法:本实验从材料的透明度、最大抗拉力、密度、孔隙率、含水饱和度、体外降解率、细胞毒性、组织相容性、体内降解率、胶原排列、前弹力层结构、单纯材料对角膜缺损的修复等方面对两种材料进行了比较。结果:晾干材料干燥状态下白光透过率为92±2%,复水后为87±1%;冻干材料干燥状态下白光透过率为28±4%,复水后为59±1%;复水前后晾干材料的透明度明显高于冻干材料。晾干材料的最大抗拉力为14.0±1.7N;冻干材料为3.1±0.6N,其差异均有统计学意义,晾干材料的抗拉力大于冻干材料。晾干材料的密度为1.013±0.122g/cm3,冻干材料的密度为0.301±0.047 g/cm3,其差异具有统计学意义,晾干材料的密度大于冻干材料;晾干材料的孔隙率为60.83±4.92%,冻干材料的孔隙率为89.28±3.27%,其差异具有统计学意义,晾干材料孔隙率低于冻干材料。晾干材料的含水饱和度为74.5±3.2%,冻干材料为91.9±1.2%,其差异具有统计学意义,晾干材料的含水饱和度低于冻干材料。体外降解实验中,直径6.5mm大小的晾干材料在1%胶原酶中10h完全降解,同样大小的冻干材料6.5h完全降解,说明晾干材料更能耐受胶原酶的降解。MTT检测细胞毒性证明,两种材料均有良好的生物相容性,且在第3、5天,材料浸提液组L929细胞的增殖均高于常规培养液组,推测材料中可能保存了存进细胞增殖的成分。大鼠皮下移植实验证明两种材料均具有良好的组织相容性,未发生免疫排斥反应,2周时,晾干材料周围可见少量炎细胞浸润,冻干材料的周围及内部均有炎细胞浸润,之后炎细胞浸润开始减轻,8周时,已无明显炎细胞浸润。材料逐渐与组织融合并降解,组织中的细胞可长入材料内部,晾干材料胶原始终保持规则的排列,细胞在其孔隙内的排列亦均匀、规则;冻干材料的胶原呈多孔状,材料内部孔隙中细胞密度较大,排列欠规则,胶原的降解速度高于晾干材料。SEM下观察,晾干材料前弹力层表面平滑,无断裂及破损,无残余细胞及细胞碎片;侧面观胶原呈半层状排列;冻干材料前弹力层表面有嵴状突起,无断裂及破损,未见残余细胞及细胞碎片;侧面观胶原呈多孔状,板层结构消失。TEM下观察,晾干材料胶原排列较正常角膜胶原排列疏松,但基本保留了胶原的规则板层结构;冻干材料胶原排列紊乱,呈多孔状,失去了规则的板层状结构。板层角膜移植修复角膜缺损的实验中,两种材料均有良好的生物相容性,无一发生排斥反应,除外冻干材料组中一例植片由于外力脱落外,两组中其余角膜缺损均得以修复,晾干材料的透明度优于冻干组,晾干组自体上皮细胞增殖、爬行至植片并形成完整角膜上皮层的时间为术后第10天,冻干组为第17天。晾干组在14天时开始有新生血管长入植片,在19-28天时达到高峰,统计新生血管的面积为,冻干组在术后12天开始有新生血管长入,16-31天时达到高峰。4周时,统计新生血管的面积,晾干组为4.1888±0.4832,冻干组为24.5664±0.7602,其差异具有统计学意义,晾干组新生血管面积低于冻干组。结论:通过对二者物理学特征、生物学特征、对角膜缺损修复效果的比较,我们认为晾干材料更适合作为组织工程角膜支架材料。